复方硝酸甘油凝胶对大鼠皮肤溃疡创面的调节作用

程静，梅蕊，刘忠，刘萍，梅利平，宋红萍

(1.华中科技大学同济医学院附属普爱医院药剂科，武汉 430033；2.武汉市精神卫生中心精神科，武汉 430023)

复方硝酸甘油凝胶对大鼠皮肤溃疡创面的调节作用

程静1，梅蕊2，刘忠1，刘萍1，梅利平1，宋红萍1

(1.华中科技大学同济医学院附属普爱医院药剂科，武汉 430033；2.武汉市精神卫生中心精神科，武汉 430023)

目的研究复方硝酸甘油凝胶剂对大鼠皮肤溃疡的保护作用及其机制。方法建立54只大鼠皮肤溃疡模型，随机分成3组，每组18只，即模型对照组、京万红组、复方硝酸甘油凝胶剂组，观察创面大体情况及愈合时间，计数造模后第7天、第14天创面的成纤维细胞数、新生毛细血管数。采用反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)法测定造模后第7天、第14天创面的血管内皮生长因子(VEGF)、血管生成素-1(Ang-1)、低氧诱导因子(HIF-1α) mRNA表达。结果与模型对照组比较[(24.17±5.91) d]，复方硝酸甘油凝胶剂能明显缩短皮肤愈合时间[(14.67±3.76) d，P<0.01]。与模型对照组比较，复方硝酸甘油凝胶组增加造模后第7天创面中成纤维细胞[(61.20±7.56)个]和新生毛细血管数量[(9.35±1.43)个，P<0.05]；上调VEGF(1.692±0.196)、HIF-1α(1.527±0.174)、Ang1(1.548±0.203)mRNA表达(P<0.05或P<0.01)；降低造模后第14天创面中成纤维细胞(28.00±5.96)个和新生毛细血管数量[(4.20±1.30)个，(P<0.01)]；下调VEGF(1.156±0.123)、HIF-1α(1.021±0.105)、Ang1(1.034±0.134) mRNA表达(P<0.05)。结论复方硝酸甘油凝胶剂通过调节成纤维细胞、新生毛细血管数量和VEGF/Ang1/HIF-1α信号转导通路达到治疗皮肤溃疡的作用。

硝酸甘油凝胶剂，复方；溃疡，皮肤；成纤维细胞；新生毛细血管；信号转导通路

皮肤溃疡是临床上的常见病之一，分为急性和慢性两类，是由于多种原因导致体表皮肤缺损或溃烂而形成创面的一种疾病。此病可发生在身体各处，多易久治不愈，常给患者造成比较大的痛苦。治疗药物主要有前列腺素、表皮细胞生长因子、碱性成纤维细胞生长因子等药物，但是费用昂贵，疗程很长，且疗效不理想，寻找更有效治疗药物是一个重要的研究方向[1]。硝酸甘油临床主要用于治疗心脑血管疾病，如心绞痛、急性心肌梗死、慢性充血性心力衰竭等。近几年，有研究报道将硝酸甘油软膏局部用于治疗肛裂，明显促进伤口愈合[2]。笔者查阅国内外文献，未见硝酸甘油凝胶剂的报道。为此本研究以新生毛细血管及成纤维细胞是溃疡创面肉芽的主要构成成分为对象，探讨复方硝酸甘油凝胶剂治疗皮肤溃疡的作用及初步作用机制。

1 材料与方法

1.1 动物 无特定病原体(specific-pathogen free,SPF)级，雄性斯泼累格·多雷(Sprague Dawley，SD)大鼠54只，体质量220～250 g，由湖北省实验动物研究中心提供，实验动物合格证号：SCXK(鄂)2008-0005；使用许可证号：SYXK(鄂)2008-0014。动物自由进食饮水，12 h明暗交替光照，环境温度22～24 ℃，相对湿度45%～75%。

1.2 药品与试剂 复方硝酸甘油凝胶剂(实验室自制，处方由硝酸甘油5%、醋酸氯己定0.3%等成分组成，批号：120708)；京万红(天津达仁堂达二药业有限公司，批号：211509)。提取总RNA试剂盒(美国OMEGA公司，批号：R6834-01)；反转录试剂盒(大连Takar公司，批号：RR420A)；实时荧光定量试剂盒(大连Takara公司，批号：RR036Q)。

1.3 仪器 ABI 9700普通PCR仪(美国ABI公司)；ABI 7500实时荧光定量PCR仪(美国ABI公司)；EPPENDORF Flus核酸蛋白测定仪(德国Eppendorf公司)。

1.4 动物造模与分组 SD大鼠进行皮肤溃疡造模，实验前背部皮肤靠近头部剪毛后涂抹8%硫化钠脱毛，脱毛面积为3.5 cm×3.5 cm。用7%水合氯醛21 g·kg-1腹腔内麻醉，俯卧固定于木板上，聚维酮碘消毒，将直径为2 cm的圆形图章在背部正中印出标记，剪去全层皮肤及皮下结缔组织，深至筋膜，用50%冰醋酸涂创面，1次·d-1，共1周。将造模后大鼠按体质量随机分为3组，每组18只。动物皮肤给药按照每平方厘米计算分别为复方硝酸甘油凝胶剂组(0.98 g·kg-1)、京万红组(京万红0.79 g·kg-1)、模型对照组(等量基质)。各组于造模次日开始换药，将药膏直接涂布于创面上，京万红组涂布京万红，模型对照组涂布基质。3组换药后均在创面上加盖一层薄膜，用医用胶带固定，换药至创面愈合。3组分别在造模后第7天、第14天每组各处死大鼠6只，取创面中心肉芽组织苏木精-伊红(hematoxylin-eosin，HE)染色。剩下大鼠继续给药[3]。

1.5 标本采集及指标观察 ①创面大体情况观察：每日换药时观察创面愈合情况如创面水肿渗出程度、是否干燥、有无分泌物、创面红肿变化等。②记录各组创面完全愈合所需时间：以创面完全上皮化作为判断愈合依据。③组织学检查：造模后第7天、第14天取各组动物创面组织进行常规HE染色，由病理医师采用光镜进行每个标本随机观察视野5个(每张切片取长方形四角及中心点视野5个)，应用Mias图像分析系统3.0确保每个视野面积相等均为一帧图像大小，图像放大倍数为400倍，每个视野面积中避开毛细血管光镜下观察并计数肉芽组织中成纤维细胞数，取5个视野的平均值作为其计数。每个标本随机观察3个视野，同法计数新生毛细血管数，取3个视野的平均值作为其计数。④取造模后第7天、第14天的3组动物创面100 mg加入1 mL Trizol进行裂解，采用反转录-聚合酶链反应(reverse transcription-polymerase chain reaction，RT-PCR)测定血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)、血管生成素-1(angiopoietin-1，Ang-1)、低氧诱导因子(hypoxia inducible factor-1-alpha，HIF-1α)mRNA表达。VEGF上游引物：5′GGTGAGAGGTCTAGTTCCCC3′，下游引物：5′CCATGAACTTTCTGCTCTTC3′。Ang1上游引物：5′TAAATCAAACATCCC3′，下游引物：5′AGGTGTC-CAGCTCTTCCT3′。HIF-1α上游引物：5′ACGTGT-TATCTGTCGCTTTG3′，下游引物：5′TAGGTTTCT-GCTGCCTTGTAT3′。内参选择β-actin。

2 结果

2.1 观察创面结果 复方硝酸甘油凝胶剂组创面湿润洁净，创面周边及基底部可见鲜红的肉芽组织，有少量炎性分泌物，淡黄色，稀薄，可见淡红色新生上皮由四周向创面中心生长。用药15 d后，大部分创面已愈合，留下一道瘢痕，可见毛发覆盖。京万红组：创面干燥结痂，暗红色，创面周围新生上皮向中心生长，生长较快。模型对照组：有大量炎性分泌物，创面干燥结痂，将其痂取下，发现创面皮肤下均有小空洞，有部分皮肤发白发灰，仅见少量新生上皮生长，而且愈合慢。伤口较复方硝酸甘油凝胶剂用药组恢复慢，同期情况下伤口面积较其他两组大。

2.2 创面愈合时间 模型对照组平均愈合时间为(24.17±5.91) d，复方硝酸甘油组平均愈合时间为(14.67±3.76) d，京万红组平均愈合时间为(18.97±2.58) d。与模型对照组比较，复方硝酸甘油凝胶剂创面完全愈合所需时间明显缩短(t=3.322，P<0.01)，具有促进体表皮肤愈合的作用。

2.3 对创面成纤维细胞、新生毛细血管的影响 与模型对照组比较，京万红组第7天成纤维细胞数量明显增加(t=2.427，P<0.05)复方硝酸甘油凝胶剂组给药后第7天成纤维细胞、新生毛细血管数量明显增加(t=2.390，t=2.237，P<0.05)。见图1。与模型对照组比较，京万红组和复方硝酸甘油凝胶剂组给药后第14天成纤维细胞、新生毛细血管数量均明显减少(t=3.002，t=3.117，P<0.01)。见表1。表明复方硝酸甘油凝胶剂对溃疡创面修复过程肉芽组织中成纤维细胞、新生毛细血管数量具有良好的调节作用。

A.模型对照组；B.京万红组；C.复方硝酸甘油凝胶剂组

表1 3组大鼠创面成纤维细胞、新生毛细血管数量的比较

Tab.1 Comparison of the numbers of fibroblasts and new blood capillaries in skin ulcer wound among three groups of rats

个

与模型对照组同时间点比较，*1P<0.05，*2P<0.01

Compared with model control group at same time point，*1P<0.05，*2P<0.01

2.4 对创面VEGF、HIF-1α、Ang1 mRNA表达的影响 与模型对照组比较，复方硝酸甘油凝胶剂组给药后第7天的VEGF、HIF-1α、Ang1 mRNA表达明显增加(t=2.331，t=2.927，t=2.666，P<0.05或P<0.01)。与模型对照组比较，复方硝酸甘油凝胶剂组给药后第14天的VEGF、HIF-1α、Ang1 mRNA表达明显减少(t=2.253，t=2.368，t=2.325，P<0.05)。表明复方硝酸甘油凝胶剂对溃疡创面修复过程肉芽组织中VEGF、HIF-1α、Ang1 mRNA表达具有良好的调节作用。见表2。

3 讨论

表2 3组大鼠创面VEGF、HIF-1α、Ang1 mRNA表达的比较

Tab.2 Comparison of the mRNA expression of VEGF, HIF-1α and Ang1 mRNA among three groups of rats

组别与时间VEGFHIF⁃1αAng1模型对照组 第7天1．418±0．2111．254±0．1481．293±0．117 第14天1．324±0．1351．202±0．1551．244±0．176京万红组 第7天1．639±0．136∗11．436±0．133∗11．461±0．141∗1 第14天1．222±0．1241．103±0．1481．214±0．196复方硝酸甘油凝胶剂组 第7天1．692±0．196∗11．527±0．174∗21．548±0．203∗2 第14天1．156±0．123∗11．021±0．105∗11．034±0．134∗1

与模型对照组同时间点比较，*1P<0.05，*2P<0.01

Compared with model control group at same time point，*1P<0.05，*2P<0.01

由于凝胶具有良好的生物相容性，对药物释放具有缓释和控释作用，形状美观，易于涂布使用，局部给药后易吸收，不污染衣物，稳定性较好，近年来成为局部外用制剂的研发热点[4]。2010年一项Meta分析显示，与安慰药组比较，连续3周给予硝酸甘油软膏明显促进伤口愈合(P<0.01)，可能是硝酸甘油增加黏膜下血液流动，舒张血管改善溃疡的缺血状态，同时缓解疼痛[5]。醋酸氯己定为消毒防腐剂，能够杀灭创面感染的细菌，具有抗炎作用。笔者在本实验中研究将硝酸甘油与醋酸氯己定制成凝胶剂，在皮肤表面形成透明的薄膜，能保证创面湿润、能较长时间与创面紧密粘附，渗透性好，易于吸收，避免换药时对创面新生组织的损伤。

VEGF是血管新生的主要调控因子，作用最强的促血管内皮细胞生成的调控因子，刺激血管内皮细胞分裂增殖从而增加微血管新生，又可提高血管通透性，从而促进创面的生长愈合。ANN等[6]在研究中发现新生毛细血管能改善创面微循环，同时带走不利于创面的代谢产物及毒物。有研究显示如果创面中VEGF可保持持续性分泌状态，对加速创面愈合具有重要意义[7]。Ang1能通过旁分泌途径诱导内皮细胞迁移，被证明与血管新生密切相关。Ang1可刺激血管渗透率增加，或通过内皮细胞释放TGF-β和血小板衍生生长因子B增加，作用于FGF-4激活VEGF表达，从而促进血管生成[8]。HIF-1α作为必需的多样血管生成因子在创面愈合中有非常重要的作用。研究表明由于HIF-1将各种血管形成因子作为靶基因，如VEGF、PLGF、Ang等，使用HIF-1α基因治疗后，创面愈合速度明显加快，血管新生数量也明显增多[9]。因此，VEGF/ Ang1/HIF-1α信号转导通路具有促进创面愈合血管化的作用。

本研究结果显示，复方硝酸甘油凝胶剂组给药后第7天与血管新生相关的VEGF、HIF-1α、Ang1基因表达均较模型对照组增加，且3个基因表达水平高于京万红组，而第14天的3个基因表达水平均较模型对照组降低，而京万红组第14天对3个基因表达无影响，同时同一组3个基因表达水平第14天较第7天降低，呈现先促进后抑制的作用方式。与病理学检查相一致：给药后第7天复方硝酸甘油凝胶剂组新生毛细血管数目较模型对照组增加，且同一组第14天较第7天毛细血管数目减少。同时也与创面愈合分期一致。炎症期：一般从创伤即刻开始维持3～5 d，以凝血及炎症为特点；增殖期：又称修复期，一般为伤后4～14 d，包括上皮形成、新生毛细血管形成、肉芽组织形成3个过程；重塑期：指伤后8 d～1年。主要包括胶原纤维强度增高，降解多余的胶原纤维，过剩的毛细血管网消退等[10-11]。

综上所述，复方硝酸甘油凝胶剂能明显缩短溃疡创面愈合时间，促进创面愈合，其机制可能通过调节VEGF/Ang1/HIF-1α信号转导通路，早期前7 d通过上调VEGF、HIF-1α、Ang1 mRNA表达，增加新生毛细血管数量，改善溃疡创面微循环；同时增加成纤维细胞数量，促进溃疡创面肉芽组织的形成。14 d后通过下调VEGF、HIF-1α、Ang1 mRNA表达，降低新生毛细血管数和成纤维细胞数量，利于创面重塑修复。

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Effect of Compound Nitroglycerin Gel on Skin Ulcer Wound in Rats

CHENG Jing1, MEI Rui2, LIU Zhong1, LIU Ping1，MEI Liping1, SONG Hongping1

(1.DepartmentofPharmacy,PuaiHospital,TongjiMedicalCollege,HuazhongUniversityofScienceandTechnology,Wuhan430033,China； 2.DepartmentofPsychiatry,WuhanMentalHealthCenter,Wuhan430023,China)

Objective To study the protective effect of compound nitroglycerin gel on rats with skin ulcer wound and its action mechanism. Methods Skin ulcer modle of 54 rats was established.Then the rats were randomly divided into three groups (n=18 each), including model control group,Jinwanhonggroup, and compound nitroglycerin gel group.Wound healing process and healing time were recorded.At the day 7 and 14 after the model was established, the number of fibroblasts and new blood capillaries of granulation tissue from center of the wound were measured,and RT-PCR was used to detect mRNA expression levels of VEGF, Ang1 andHIF-1α. Results As compared with model control group [(24.17±5.91) days], healing time of skin in the compound nitroglycerin gel group was significantly shorter [(14.67±3.76) days,P<0.01].The numbers of fibroblasts (61.20±7.56) and new blood capillaries (9.35±1.43) were increased, and mRNA expression levels of VEGF (1.692±0.196), HIF-1α (1.527±0.174) and Ang1 (1.548±0.203) were remarkably up-regulated on 7thday (P<0.05 orP<0.01).While on 14thday, the numbers of fibroblasts (28.00±5.96) and new blood capillaries (4.20±1.30) were decreased and the mRNA expression levels of VEGF (1.156±0.123), HIF-1α (1.021±0.105) and Ang1 (1.034±0.134) were significantly down-regulated (P<0.05 orP<0.01). Conclusion Compound nitroglycerin gel can treat skin ulcer wound via regulating the numbers of fibroblasts, new blood capillaries and VEGF/Ang1/HIF-1α signal transduction pathway.

Nitroglycerin gel, compound；Ulcer, skin； Fibroblast； New blood capillary； Signal transduction pathway

2014-09-24

2014-12-04

程静(1983-)，女，湖北武汉人，主管药师，硕士，研究方向：药理学。电话：027-68834860，E-mail：chengjing-429521@163.com。

宋红萍(1968-)，女，湖北随州人，主任药师，硕士，研究方向：药剂学。电话：027-68835024，E-mail：Songhongping@126.com。

R965；R751

A

1004-0781(2015)12-1591-04

10.3870/j.issn.1004-0781.2015.12.011