白藜芦醇对人肾细胞癌786-0细胞存活素及p27蛋白表达的影响

涂睿，刘孝桥

(1.三峡大学第三临床医学院，宜昌 443000；2.湖北省宜昌市葛洲坝中心医院肿瘤科，宜昌 430071；3.湖北省宜昌市中心人民医院儿科，宜昌 443003)

白藜芦醇对人肾细胞癌786-0细胞存活素及p27蛋白表达的影响

涂睿1，2，刘孝桥3

(1.三峡大学第三临床医学院，宜昌 443000；2.湖北省宜昌市葛洲坝中心医院肿瘤科，宜昌 430071；3.湖北省宜昌市中心人民医院儿科，宜昌 443003)

目的探讨白藜芦醇(Res)对人肾细胞癌细胞存活素、p27蛋白表达的影响。方法使用Res培养液(25 μmol·L-1)作用人肾细胞癌786-0 细胞12，24及48 h后，应用流式细胞术检测786-0细胞周期和凋亡情况，采用蛋白质免疫印迹法检测细胞存活素、p27蛋白的表达情况，以空白培养液作为对照组。结果实验组G1期[(64.87±3.76)%]及G2期[(9.91±0.82)%]比例显著性降低(P<0.05)，S期[(25.05±3.12)%]比例显著性升高(P<0.05)；实验组在12，24和48 h等不同时间点的细胞凋亡率[(5.12±0.64)%，(5.71±0.49)%，(5.84±0.30)%]均明显高于对照组[(0.72±0.27)%，(0.93±0.25)%，(1.12±0.21)%，P<0.05]；实验组存活素蛋白表达水平明显高于对照组(P<0.05)，且随时间延长表达呈显著性升高(P<0.05)；实验组p27蛋白表达水平明显低于对照组(P<0.05)，且随时间延长表达水平呈显著性降低(P<0.05)；实验组细胞存活素与p27蛋白表达之间呈负相关性关系(P<0.05)。结论Res通过抑制p27蛋白的表达而上调存活素的表达水平，进而促进肾细胞癌786-0细胞的凋亡。

白藜芦醇；癌，肾细胞；存活素；p27蛋白

白藜芦醇(reservatrol，Res)是提取自葡萄、花生和虎杖等植物的酚类化合物，其不仅具有抗炎症反应、抗氧化应激及保护神经细胞等药理作用，而且还对包括肾癌在内的多种肿瘤疾病具有治疗作用[1-2]。存活素是一种凋亡抑制基因(inhibitor of apoptosis protein，IAP)，与细胞凋亡和周期均有密切的联系。p27则为一种抑癌基因，其蛋白在细胞周期和凋亡过程中均有所参与，对细胞周期具有明显的负性调控作用。流行病学调查结果显示，肾细胞癌是常见于泌尿系统的恶性肿瘤疾病，故本研究拟探讨Res对人肾细胞癌786-0细胞存活素、p27蛋白表达的影响，为其在肾细胞癌的临床治疗应用提供实验室依据。

1 材料与方法

1.1 细胞株 人肾细胞癌786-0细胞株购自上海细胞生物学研究所。

1.2 试剂及仪器 Res购自美国Sigma公司；存活素、p27单克隆抗体购自美国Santa Cruz公司；胎牛血清购自杭州四季青生物工程材料有限公司；达尔伯克改良伊格尔培养液(Dulbecco's modified Eagle's medium，DMEM)购自上海恒远生物科技有限公司。流式细胞仪为美国贝克曼库尔特有限公司产品；RDY-ZY2型转印电泳仪购自上海欧翔科学仪器有限公司。

1.3 细胞培养方法 人肾细胞癌786-0细胞采用DMEM高糖培养液(内含20%胎牛血清，1×105U·L-1青霉素、链霉素)，在37 ℃、5%二氧化碳细胞培养箱里进行培养。

1.4 细胞周期检测方法 取处于对数生长期的人肾细胞癌786-0细胞，用Res培养液(25 μmol·L-1)培养处理24 h，以DMEM培养液作为对照组，每组需设置3个实验复孔。离心处理后收集1×106·mL-1细胞，使用磷酸盐缓冲液(phosphate buffered solution，PBS)洗涤后，使用PI复合染液在避光位置染色处理20 min，采用流式细胞仪对各组细胞周期予以检测，用流式细胞仪在激发波长488 nm处检测红色荧光，同时检测光散射情况。采用分析软件进行细胞DNA含量分析和光散射分析。

1.5 细胞凋亡检测方法 取处于对数生长期的人肾细胞癌786-0细胞，用Res培养液(25 μmol·L-1)培养处理12，24和48 h，每组需设置3个复孔。4 ℃条件下2 000 r·min-1(r=6 cm)离心处理后收集1×106·mL-1细胞，加入Annexin-V-FITC试剂在4 ℃条件下进行反应，加入PI复合染液10 μL，用流式细胞仪对细胞凋亡进行分析。

1.6 存活素、p27蛋白表达检测方法 采用蛋白质免疫印迹(Western blot)法检测各组细胞存活素、p27蛋白表达水平，在94 ℃温度条件下加热处理10 min，然后使用分离胶对组织样品予以十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰氨凝胶(SDS-PAGE)电泳，从凝胶组织中将蛋白质物质转移至滤膜上，电泳转印处理后行Western blot检测，一抗以1：200予以稀释处理，二抗则以1：750予以稀释处理，采用二氨基联苯胺染色(3,3'-diaminobenzidine,DAB)试剂盒显色处理，如有蛋白质条带出现立即用大量PBS溶液冲洗以终止Western blot反应过程，实验结果采用专用扫描仪器分析和处理，其中存活素为16 000，p27蛋白为27 000，目的蛋白/GAPDH的灰度比值表示其蛋白的相对表达水平。

2 结果

2.1 Res对人肾细胞癌786-0细胞周期的影响 用Res培养液(25 μmol·L-1)培养处理人肾细胞癌786-0细胞24 h后，实验组G1期及G2期比例显著性降低(P<0.05)，S期比例显著性升高(P<0.05)。见表1。

表1 两组人肾细胞癌786-0细胞周期的比较

Tab.1 Comparison of cell cycle between two groups of human renal carcinoma 786-0 cells

组别G1期S期G2期对照组75．42±4．3413．22±2．0811．30±1．33实验组64．87±3．76∗125．05±3．12∗19．91±0．82∗1

与对照组比较，*1P<0.05

Compared with control group，*1P<0.05

2.2 Res处理不同时间对人肾细胞癌786-0细胞凋亡的影响 实验组在12，24和48 h等不同时间点的细胞凋亡率均明显高于对照组(P<0.05)。见表2，图1。

表2 两组不同时间点人肾细胞癌786-0细胞凋亡率的比较

Tab.2 Comparison of apoptosis between two groups of human renal carcinoma 786-0 cells at different time points

组别12h24h48h对照组0．72±0．270．93±0．251．12±0．21实验组5．12±0．64∗15．71±0．49∗15．84±0．30∗1

与对照组比较，*1P<0.05

Compared with control group，*1P<0.05

2.3 Res处理不同时间对人肾细胞癌786-0细胞存活素、p27蛋白表达的影响 实验组存活素蛋白表达水平明显高于对照组(P<0.05)，且随时间延长表达呈显著性升高(P<0.05)；实验组p27蛋白表达水平明显低于对照组(P<0.05)，且随时间延长表达水平呈显著性降低(P<0.05)。见表3，图2。

2.4 存活素、p27蛋白表达的相关性分析 实验组细胞存活素与p27蛋白表达之间呈负相关性关系(P<0.05)。

3 讨论

Res是植物受到某些因素侵害时产生的一种抗毒

图1 两组人肾细胞癌786-0细胞不同时间点凋亡流式细胞图

表3 两组不同时间点人肾细胞癌786-0细胞存活素、p27蛋白表达的比较

Tab.3 Comparison of the expression of survivin and p27 protein between two groups of human renal carcinoma 786-0 cells at different time points

组别与时间例数存活素/GAPDHp27/GAPDH对照组30 12h0．57±0．110．87±0．21 24h0．55±0．130．85±0．22 48h0．59±0．150．88±0．24实验组27 12h0．74±0．17∗10．65±0．12∗1 24h0．97±0．21∗1∗20．51±0．08∗1∗2 48h1．21±0．24∗1∗20．42±0．07∗1∗2

与对照组同时间点比较，*1P<0.05；与本组前一时间点比较，*2P<0.05

Compared with control group at same time point，*1P<0.05；compared with same group at former time point，*2P<0.05

素，其药理作用十分广泛，除已知多种药理作用外，还有较多实验研究发现，Res对肾细胞癌、结肠癌、乳腺癌和肺癌等均有明显的治疗作用，但作用机制仍未研究清楚[3]。目前主要认为Res通过对肿瘤细胞的增殖过程加以抑制，进而使得细胞周期表现出明显的易变性。国内相关研究发现，肾细胞癌细胞G0/G1期细胞的比例显著升高，而S期细胞比例明显降低，最终肿瘤细胞在G1期停止[4-5]。国外实验研究则发现，Res可促进细胞周期依赖性激酶(cyclin-dependent kinases，CDK)抑制蛋白WAF1/p21的表达水平，使得癌细胞在S期停止[6]。本研究采用流式细胞仪对细胞周期进行检测，结果显示G1期及G2期细胞比例显著性降低，而S期细胞比例明显升高，与上述结果相符，且细胞凋亡率明显高于对照组，由此可知Res将786-0细胞阻滞在S期，并且诱导细胞出现凋亡现象。

图2 两组不同时间点人肾细胞癌786-0细胞存活素、p27蛋白的表达

Fig.2 Comparison of the expression of survivin and p27 protein between two groups of human renal carcinoma 786-0 cells at different time points

存活素蛋白是一种IAP家族新成员，在肿瘤组织中存活素均呈异常的高表达水平，且与肿瘤疾病的预后情况有着密切的联系。研究发现，其不但能抑制细胞的凋亡现象，还能对细胞的有丝分裂过程予以调节，通过抑制Caspase-3、Caspase-7的生物学活性作用对细胞的凋亡现象加以抑制，存活素表达水平增高可协助克服G2/M期检测点，通过有丝分裂这种方式促进细胞的增殖过程[7-8]。p27蛋白对细胞周期具有负性调节和控制作用，主要通过抑制CDK的生物学活性作用，使得细胞在G1期出现阻滞现象，抑制其进入S期，进而对细胞的增殖过程加以抑制，使得细胞有时机去修复已受到严重损伤的DNA[9]。p27蛋白表达水平下降则会减低其对CDK生物学活性作用的抑制效应，细胞得以顺利完成细胞周期G1/S期的转化过程，细胞增殖速度明显增快，促进肿瘤疾病的发生、发展等过程。

本研究结果显示，实验组存活素或p27蛋白表达水平明显高(或低)于对照组，且随时间延长表达呈显著性升高(或降低)，且存活素与p27蛋白表达之间呈负相关性关系，此结果与国内外相关研究相符，证实存活素蛋白高表达和p27蛋白低表达与肾癌的发生、发展有密切相关性[10-11]。存活素蛋白表达的异常使得细胞凋亡抑制作用失去正常控制，同时p27蛋白表达水平降低，使得细胞增殖能力明显加强，两者共同发挥作用，促进肿瘤细胞和组织的发生及发展过程[10]。此外存活素具有细胞周期依赖性表达的生理学特性，主要在G2/M期表达，而p27能使细胞产生G1期阻滞，导致存活素表达水平明显下降，这可能是p27下调存活素表达的主要原因[12]。由此推测，Res可通过抑制p27蛋白的表达水平而上调存活素的表达水平，进而促进肾细胞癌786-0细胞的凋亡。

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Effect of Resveratrol on the Expression of Survivin and p27 Protein in Human Renal Cell Carcinoma 786-0 Cells

TU Rui1, 2, LIU Xiaoqiao3

(1.NO.3ClinicMedicineSchool,SanxiaUniversity,Yichang443000,China； 2.DepartmentofOncology,theCenterHospitalofGezhoubainYichang,Yichang430071,China； 3.DepartmentofPediatrics,theCenterPeople'sHospitalofYichang,Yichang443003,China)

Objective To investigate the effect of resveratrol (Res) on the expression of survivin, p27 protein in human renal cell carcinoma 786-0 cells. Methods The cell cycle and apoptosis of 786-0 cells were detected by flow cytometry, and the expression of survivin and p27 protein of 786-0 cells was detected by Western blotting at time point of 12, 24 and 48 h after human renal cell carcinoma 786-0 cells were cultured with Res (25 μmol·L-1) and blank medium, respectively. Results The ratio in G1phase [(64.87±3.76)%] and G2phase [(9.91±0.82)%] in the experimental group decreased significantly (P<0.05), and the ratio of S phase [(25.05±3.12)%] increased significantly (P<0.05).The apoptosis rate of experimental group at 12, 24 and 48 h [(5.12±0.64)%, (5.71±0.49)%, (5.84±0.30)%] was significantly higher than that of the control group [(0.72±0.27)%, (0.93±0.25)%, (1.12±0.21)%,P<0.05].The expression of survivin protein in experimental group was significantly higher than that of the control group (P<0.05), and the expression was significantly increased with time prolonging (P<0.05).The expression of p27 protein in experimental group was significantly lower than that of the control group (P<0.05), and the expression level was significantly decreased in time-dependent manner (P<0.05).There was a negative correlation between the expression of survivin and p27 protein in the experimental group (P<0.05). Conclusion Res could inhibit the expression of p27 protein and up-regulate survivin expression level, and promote the apoptosis of renal cell carcinoma 786-0 cells.

Resveratrol； Carcinoma, renal cell； Survivin； p27 protein

2014-12-06

2015-01-23

涂睿(1982-)，男，湖北宜昌人，在读硕士，研究方向：肿瘤疾病诊断与治疗。电话：(0)13477122493，E-mail：turuiyc@126.com。

R285.5；R739.9

A

1004-0781(2015)12-1572-04

10.3870/j.issn.1004-0781.2015.12.006