蓝莓叶总黄酮的体外抗炎功效评价

赵 丹，苏 宁，杨 丽，郑洪艳，霍 彤，王昌涛,*

蓝莓叶总黄酮的体外抗炎功效评价

赵 丹1，苏 宁2，杨 丽2，郑洪艳2，霍 彤1，王昌涛1,*

（1.北京工商大学理学院，北京 100048；2.中国检验检疫科学研究院，北京 100176）

目的：通过体外实验方法从分子水平对蓝莓叶总黄酮的抗炎功效进行评价。方法：建立人永生化表皮细胞HaCaT与蓝莓叶总黄酮的共培养体系，利用反转录实时荧光定量聚合酶链式反应检测在不同培养时间点（0、15、30、60、120 min）白细胞介素-6（interleukin-6，IL-6）、IL-8、干扰素诱导蛋白-10（interferon-inducible prot ein-10，IP-10）等炎症细胞因子相关基因表达情况，观察蓝莓叶总黄酮的添加对这些基因表达的影响，并探讨蓝莓叶总黄酮在分子水平上的抗炎机理。结果：蓝莓叶总黄酮的添加能够提高抗炎因子IL-6、CXCR-2基因的表达量（P＜0.05），降低促炎因子IL-8、IP-10基因的表达量（P＜0.05），对CXCR-1基因的表达呈复杂型调节。结论：蓝莓叶总黄酮通过对炎症相关因子表达量产生影响，从而减弱促炎症反应，增强抗炎症反应，最终发挥抗炎功效。

蓝莓叶总黄酮；炎症因子；反转录实时荧光定量聚合酶链式反应；抗炎

由于动物实验所存在的伦理问题以及国际上对动物福利的日益关注，发展新的体外实验方法用以减少、优化和替代（reduction, refinement, replacement，3R理论）动物实验成为当前研究的热点。反转录实时荧光定量聚合酶链式反应（real-time reverse transcription quantitative polymerase chain reaction，RT-qPCR）技术因其具有特异性强、灵敏度高以及重复性好等优势，在动物替代实验领域发挥了日益重要的作用。此技术不仅避免了PCR产物污染产生的假阳性结果和非特异性扩增问题，同时还能够对标本模板进行精确定量[1-2]。

皮肤在受到外界药物刺激后会发生炎症反应。 在这个过程中，白细胞介素-6（interleukin-6，IL-6）、IL-8、干扰素诱导蛋白-10（interferon-inducible protein-10，IP-10）等炎症因子和趋化因子的相关基因表达会受到影响。IL-6能够刺激参与免疫反应的细胞增殖、分化并提高其功能活性；IL-8是巨噬细胞和上皮细胞等分泌的细胞因子，与其受体CXCR-1和CXCR-2结合而对中性粒细胞产生细胞趋化作用，从而实现对炎症反应的调节[3-5]。

本实验利用反转录实时荧光定量PCR技术，检测在人类永生化表皮细胞HaCaT培养体系中蓝莓叶总黄酮的添加对这些细胞因子表达量的影响，从而进一步对这些细胞因子的表达与皮肤炎症反应的关系进行研究。

1 材料与方法

1.1材料与试剂

HaCaT细胞，购自上海斯信生物科技有限公司。

DMEM低糖培养基、二甲基亚砜 德国Sigma公司；胎牛血清 美国Gibco公司；青霉素-链霉素双抗（100×） 美国Corning公司。

1.2仪器与设备

WJ-80A-ⅡCO2培养箱 上海圣科仪器设备有限公司；ABI 7300型实时荧光定量PCR仪、GeneAmp PCR System 9700美国ABI应用生物系统公司；Enduro水平电泳仪 美国Labnet公司；3-30K台式高速冷冻离心机、1-14微型离心机 德国Sigma公司；SW-CJ-1D超净工作台 上海启前电子科技有限公司；细胞培养瓶、细胞培养瓶板、细胞冻存管 美国Corning/Costar公司。1.3方法

1.3.1细胞培养及处理

从-80℃冰箱中取出待用冻存的HaCaT细胞，迅速置于37℃水浴中解冻，在1～2 min内轻微振动使其融化。1 000 r/min离心10 min，弃去上清液，在沉淀中加入1 mL DMEM完全培养液，转移至25 cm2培养瓶中，37℃、5%CO2培养。当细胞生长至90%融合时，用2 mL磷酸盐缓冲液（phosphate buffered saline，PBS）轻柔清洗两次，加入200μL0.25%胰酶后放入CO2培养箱中消化5 min，放到显微镜下观察，当确认细胞从培养瓶壁上脱落后，加入2 mL DMEM完全培养液终止消化，800 r/min离心10 min，弃去上清液，加入4 mL培养液，进行细胞计数后，以5×105个/cm2的密度接种于25 cm2培养瓶中。

将消化后的HaCaT细胞以2×106个/孔的密度接种于6孔板内，以60μg/mL质量浓度蓝莓叶总黄酮处理细胞0、15、30、60、120 min。

1.3.2细胞总RNA提取与检测

待细胞密度长至80%时，冰浴条件下，依次加入1 mL Trizol、0.2 mL氯仿，手摇振荡2 min；4℃、8 000 r/min离心15 min，取上层水相，加入等体积异丙醇（约700μL），振荡，静置15 min；12 000 r/min离心10 min，弃去上清液，向沉淀中加入1 mL 70%乙醇洗涤，8 000 r/min离心10 min；重复进行1次乙醇洗涤；室温条件下干燥15 min，加入40μL经焦碳酸二乙酯（diethyl pyrocarbonate，DEPC）处理的ddH2O，溶解10 min后于-80℃保存[6-7]。

琼脂糖凝胶电泳检测RNA：将样品和Marker加至凝胶上样孔，180 V电压电泳10 min。

1.3.3 cDNA第一链合成

使用TINAGEN FastQuantRTKit（含gDNase）FastQuant cDNA第一链合成试剂盒（去基因组）进行cDNA第一条链合成反应。

1.3.4反转录实时荧光定量PCR分析

1.3.4.1引物设计

根据NCBI中发布的IL-6、IL-8、IP-10等基因的序列，通过Primer Express软件设计特异性引物，同时设计管家基因β-actin的特异性引物，各基因的引物序列见表1。

表1 qRT-PCR引物序列Table1 Primer sequences for qRT-PCR

1.3.4.2 反转录实时荧光定量PCR反应

以cDNA为模板，按照表2配制RT-qPCR反应体系（使用前，在1 mL PrimeScriptRTEnzyme MIX中加入40μL的ROX Reference Dye），用ddH2O将反应体系补足到20μL，分析IL-6、IL-8、IP-10等基因的表达量。

表2 反转录实时荧光定量PCR反应体系Table2 Real time fluorescence quantitative reverse transcription PCRTable2 Real time f reaction system stem

2 结果与分析

2.1 HaCaT细胞培养

图1为HaCaT细胞培养贴壁前后形态比较，贴壁前HaCaT细胞为规则的圆球体状，透明饱满，且可随培养液流动。当培养2～4 h以后，HaCaT细胞开始呈现出片层状态贴壁生长，单个细胞形态不规则，其形态会因其所处培养空间大小的具体情况不同而变化；另一方面，随着培养液中营养物质的消耗和HaCaT细胞自身生长过程中代谢物的产生，培养液的颜色（随pH值变化）和细胞中内容物的颜色也与贴壁前的HaCaT细胞有了显著的差别。这就决定了一定时间内需要根据培养瓶或者培养板中HaCaT细胞生长的具体情况，而定期换新鲜培养液或者进行传代培养，才能保证HaCaT细胞良好的生长状态。

图1 HaCaT细胞培养贴壁前（a）后（b）的形态（20×）Fig.1 HaCaT cells before (a) and after (b) attached culture (20 ×)

HaCaT细胞对生长环境的要求相对其他动物细胞较为宽泛。HaCaT细胞增殖速率快，培养2～4 h即可贴壁，36 h左右需要进行传代。细胞快速地增殖会引起培养液中营养物质在短时间内被大量消耗，限制了细胞进一步生长。因此，在考察蓝莓叶总黄酮对HaCaT细胞的影响时，培养时间不宜过长。综合考虑，本实验中选取培养时间分别为0、15、30、60、90、120 min，在以上6个时间点对添加蓝莓叶总黄酮的HaCaT细胞生长状况进行考察。

2.2 HaCaT细胞总RNA的提取

图2 HaCaT细胞总RNA琼脂糖凝胶电泳检测结果Fig.2 Electrophoresis of total RNA from HaCaT cells

采用1.0%琼脂糖凝胶电泳对提取的HaCaT细胞RNA进行完整性检测。如图2所示，28S rRNA与18S rRNA带型清晰。另经紫外分光光度计测定，所提取HaCaT细胞RNA的A260nm/A280nm介于1.8～2.0之间，RNA质量高，完整性好，适于反转录实时荧光定量PCR研究[8]。

严格来说，以拉斐尔前派画家之名而为人所熟知的罗塞蒂的拉斐尔前派创作期，至此已经结束了。人们应该看到，在拉斐尔前派那原本就模糊不清的理想幻灭之后，罗塞蒂绘画中的逃亡意识开始明确：他在相当长一段时间里都使用古老的水彩作画，并专注于但丁与比阿特丽丝等中世纪题材。

2.3 RT-qPCR炎症因子特异性引物的检测

利用设计的β-actin、IL-6和IL-8的引物对目标产物进行检测，结果如图3所示。以反转录得到的cDNA为模板，通过设计的引物进行扩增，得到的产物利用1%琼脂糖凝胶电泳进行检验，得到条带单一的、片段大小与预期目的条带大小一致的特异性引物，可进行下一步RT-qPCR的实验。

图3 炎症因子IL-6、IL-8特异性引物检测结果Fig.3 Electrophoresis of PCR amplified products with specific primers for β-actin, IL-6 and IL-8

2.4 RT-qPCR实验结果

以HaCaT细胞为研究对象，考虑到其炎症因子相关基因表达量变化的时间大多在2 h以内[9]，并且综合HaCaT细胞生长情况，本实验选择2 h以内作为蓝莓叶总黄酮处理HaCaT细胞的考察时间。

2.4.1蓝莓叶总黄酮对HaCaT细胞炎症因子类基因表达的影响

2.4.1.1蓝莓叶总黄酮对HaCaT细胞IL-6表达的影响

图4 蓝莓叶总黄酮处理不同时间对HaCaT细胞IL--66表达量的影响Fig.4 Influence of treatment time with blueberry leaf extracts on IL-6 expression

2.4.1.2蓝莓叶总黄酮对HaCaT细胞IL-8表达的影响

图5 蓝莓叶总黄酮处理不同时间对HaCaT细胞IL--88表达量的影响Fig.5 Influence of treatment time with blueberry leaf extracts on IL-8 expression

蓝莓叶总黄酮对HaCaT细胞IL-8表达量的影响如图5所示，培养时间在15 min内，HaCaT细胞IL-8表达量迅速下降，并在30 min内保持缓慢下降的趋势，在30～90 min内又缓慢上升，但远小于空白组，而在90～120 min的培养时间内，IL-8表达量又有下降趋势。整体来看，蓝莓叶总黄酮对IL-8基因表达的影响主要体现在培养0～15 min内迅速抑制其表达，并在120 min的培养时间内总体保持抑制其表达的作用。对不同时间段IL-8表达量进行分析，发现与空白组相比，培养至15、30 min时，HaCaT细胞IL-8表达量极显著降低（P＜0.01），而培养至60～120 min时，IL-8表达量稍有回升，但仍显著低于空白组（P＜0.05），这表明蓝莓叶总黄酮对HaCaT细胞IL-8的表达具有抑制作用。IL-8在许多炎症中具有聚集和激活T淋巴细胞、白细胞和血管内皮细胞的功能，局部产生的IL-8可以直接作用于表皮细胞，促进慢性炎症的发展[11]。IL-8表达量的升高会使大量中性粒细胞向炎症区域聚集，释放炎症介质而加重炎症反应[12-13]。蓝莓叶总黄酮抑制了IL-8的表达，从而间接地抑制了炎症的发生和发展。

2.4.2蓝莓叶总黄酮对HaCaT细胞趋化因子相关基因表达的影响

2.4.2.1蓝莓叶总黄酮对HaCaT细胞CXCR-1和CXCR-2表达的影响

CXCR-1和CXCR-2是CXCR家族中的两个重要成员，属G蛋白偶联受体超家族成员。CXCR-1和CXCR-2会表达在正常的人内皮细胞表面，在急性炎症反应过程中，趋化因子能够促进内皮细胞释放大量促炎细胞因子[14]。

图6 蓝莓叶总黄酮处理不同时间对HaCaT细胞CXCR--11表达量的影响Fig.6 Influence of treatment time with blueberry leaf extracts on CXCR-1 expression

如图6所示，添加蓝莓叶总黄酮后，HaCaT细胞CXCR-1的表达量在培养15 min内有明显升高的趋势，随后的培养过程中，CXCR-1的表达量被间隔性地促进和抑制，但总体水平都是高于空白组。对不同培养时间段HaCaT细胞CXCR-1表达量进行统计学分析，发现与空白组相比，在培养的120 min内，HaCaT细胞CXCR-1表达量的变化均不显著（P＞0.05）。以上结果表明，蓝莓叶总黄酮对HaCaT细胞CXCR-1的表达有一定促进作用，但在促进和抑制间存在一定的动态平衡。

图7 蓝莓叶总黄酮处理不同时间对HaCaT细胞CXCR--22表达量的影响Fig.7 Influence of treatment time with blueberry leaf extracts on CXCR-2 expression

如图7所示，添加蓝莓叶总黄酮后，HaCaT细胞CXCR-2的表达量在培养15 min内有平缓的升高，在随后培养的15～90 min内，保持在较高的水平，而在培养的90～120 min内，CXCR-2的表达量显著升高（P＜0.05）。以上结果表明，蓝莓叶总黄酮对HaCaT细胞CXCR-2的表达是起促进作用的。

2.4.2.2蓝莓叶总黄酮对HaCaT细胞IP-10表达的影响

图8 蓝莓叶总黄酮处理不同时间对HaCaT细胞IP-10表达量的影响Fig.8 Influence of treatment time by blueberry leaf extracts on IP-10 expression

如图8所示，添加蓝莓叶总黄酮后，HaCaT细胞IP-10表达量在培养15 min内迅速下降，并且在90 min的培养时间内保持在一个相当低的水平。虽然在培养至90～120 min内，HaCaT细胞IP-10表达量有一定的升高，但是与空白组相比仍是受到抑制的。经统计学分析发现，与空白组相比，培养至15、30 min时，HaCaT细胞IP-10表达量显著降低（P＜0.05），而培养至60、90 min时，IP-10表达量极显著降低（P＜0.01），到培养120 min时，IP-10表达量稍有回升，但仍显著低于空白组（P＜0.05）。以上结果表明，蓝莓叶总黄酮对IP-10基因的表达具有抑制作用。

3 结 论

炎症因子（IL-6、IL-8）和趋化因子（CXCR-1和CXCR-2、IP-10）是反映炎症反应的重要指标，在机体抗感染、抑病毒过程中起重要作用[15-16]。本实验将蓝莓叶总黄酮与HaCaT细胞共培养特定时间后，利用RT-qPCR检测相关炎症因子和趋化因子的表达情况。结果表明，蓝莓叶总黄酮对IL-6和CXCR-2基因的表达具有正向调节的作用，二者的表达量显著增加。其中，IL-6通过影响细胞内花生四烯酸的代谢而起到抗炎作用，CXCR-2通过与配体IL-8结合，启动中性粒细胞趋化反应，募集中性粒细胞，引起炎症反应，对入侵的病原体发挥吞噬杀伤和清除作用。IL-8和IP-10基因的表达受到了明显抑制，表达量大幅度降低，进而抑制了炎症的发生和发展。IP-10及其受体CXCR-3具有强大的招募中性粒细胞能力，可促进多种细胞因子的分泌，作为趋化因子介导Thl型炎症反应[17-18]，蓝莓叶总黄酮的添加抑制了HaCaT细胞中IP-10的表达，从而降低了炎症反应发生的概率。而蓝莓叶总黄酮对趋化因子CXCR-1的表达则呈现出复杂型调节的作用，表现为间歇性地促进和抑制，因此，蓝莓叶总黄酮具体的抗炎作用效果还有待研究。

综合来看，在炎症反应中有诸多的炎症因子和趋化因子参与到其中，这些因子之间相互作用，联系紧密，网络系统复杂多样，所以其表达量的变化必然会相互影响[19-21]。整体来看，蓝莓叶总黄酮的添加会促进抗炎因子的表达，抑制促炎因子的表达，从而发挥其抗炎作用。但是蓝莓叶总黄酮的具体抗炎机理到目前为止还不是很清楚，有待进一步研究。本实验利用RT-qPCR法对蓝莓叶总黄酮的抗炎功效进行了初步评价，为保健品或药食同源物质的体外抗炎评价提供了新思路。

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In vitro Anti-inflammatory Effect of Total Flavonoids from Blueberry Leaves

ZHAO Dan1, SU Ning2, YANG Li2, ZHENG Hongyan2, HUO Tong1, WANG Changtao1,*
(1. School of Science, Beijing Technology and Business University, Beijing 100048, China; 2. Chinese Academy of Inspection and Quarantine, Beijing 100176, China)

Purpose∶ To evaluate thein vitroanti-inflammatory potential of total flavonoids from blueberry leaves. Methods∶a co-culture system of HaCaT cell and flavonoids were constructed. To examine the effect of flavonoids on the expression of inflammatory cytokines including interleukin 6 (IL-6), interleukin-8 (IL-8), and interferon induced protein 10 (IP-10), realtime reverse transcription quantitative PCR (RT-qPCR) was used to detect the expression of the related genes after co-culture for different periods of time(0, 15, 30, 60, and 120 min). The anti-inflammatory mechanism of flavonoids from blueberry leaves was analyzed at the molecular level. Results∶ The total flavonoids from blueberry leaves significantly enhanced the expression of anti-inflammatory cytokines (IL-6andCXCR-2) (P＜ 0.05) and significantly inhibited the expression of pro-inflammatory cytokines (IL-8,IP-10) (P＜ 0.05) to achieve the anti-inflammatory activity. Chemotactic factor receptorCXCR-1was regulated complicatedly. Conclusions∶ The total flavonoids from blueberry leaves could decrease inflammation by regulating the function of several gene loci via several steps.

total flavonoids from blueberry leaves; inflammatory cytokines; real-time reverse transcription PCR; anti-inflammatory

R966

1002-6630（2015）17-0231-05

10.7506/spkx1002-6630-201517043

2014-11-05

国家质检总局质检公益性行业科研专项（201310132；201410019）

赵丹（1988—），女，助理实验师，硕士，研究方向为生物技术。E-mail：zhaodanustb@126.com

*通信作者：王昌涛（1975—），男，教授，博士，研究方向为植物功效成分开发应用。E-mail：wangct@th.btbu.edu.cn