不同林龄木麻黄浸提液的GC-MS分析

姚 瑶，李 蕾，2，刘楠楠，陈香燕，曹明奋，徐志霞＊

（1.海南师范大学 生命科学院，海南 海口571158；2.海南省热带动植物生态学重点实验室，海南 海口571158）

木麻黄（Casuarina equisetifolia）为双子叶植物纲木麻黄科木麻黄属植物，原产于澳大利亚和波利西亚等地［1］。常绿乔木，生长迅速，抗风性强，耐盐碱、贫瘠、干旱土壤。在海南省现有海防林中木麻黄是主要的海防树种，其面积达到5万hm2［2］，这些天然屏障优化了沿海地区人民的生活环境。但由于木麻黄林树种单一，人工林群落结构简单，海南许多地方的木麻黄林木枯梢、断梢，病虫害严重，出现了自然衰退现象。木麻黄林出现衰退，林分更新困难的一个重要原因是木麻黄能够分泌化感物质抑制其自身生长［3-5］。前期已经分析了不同林龄木麻黄林地土壤理化性质和生化活性以及木麻黄的浸提液对青皮生长的影响，同时也完成了木麻黄乙醚浸提液的分离与鉴定［6-11］。研究表明，木麻黄分泌的具有化感效应的物质残留于土壤中还会影响下一代木麻黄生长，从而导致木麻黄二次更新存在障碍。而这种化感效应与化感物质的产生部位、化感物质的积累有关，会随着木麻黄林龄的变化发生相应的变化。为此，对不同林龄木麻黄根、根际土壤及凋落物中的物质进行了提取与分离，并用GC-MS气质联用仪对其组分进行测定，为木麻黄化感作用的研究提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 样品采集

在海南省海口市灵山海岸和桂林洋海岸的木麻黄海防林中，按林龄划分为幼龄林（林龄5～8a）、中龄林（林龄15～20a）和成熟林（林龄30a及以上）3种林地。分别采集各林龄林地中凋落物、20～50cm的侧根及根际土壤样本。

1.2 提取方法

按1kg样品（凋落物、根、土壤）3L蒸馏水的比例进行浸泡，常温下浸泡48h并经常翻动，用纱布初滤后得到滤液。将所得滤液过0.45μm微孔滤膜，在旋转蒸发仪上进行旋转蒸发并结合冷冻干燥仪除去水分。所得样品分2组，分别加入1mL正己烷和1mL甲醇溶液萃取，最后进行GC-MS检测。

1.3 GC-MS测定

检测仪器为GC-MS（气相色谱-质谱联用仪，Thermo Finnigan120150-T230L）。色谱柱为 HP-5MS毛细管柱，固定相为（5%-苯基）-甲基聚硅氧烷。用电子轰击源轰击，电压为70eV，扫描范围m／z 30～450amu，扫描速度0.4s，扫描全程，离子源的温度为250℃。毛细管柱的规格30m×0.01 mm×0.25mm；进样口温度280℃，柱温120℃（3 min，以15℃·min-1程序升温至250℃后，保持3 min；载气为 He，流量1mL·min-1，进样量1μL。通过面积归一化法对鉴定的样品进行分析，检索数据库为 NIST 08MS Library and AMDIS。

2 结果与分析

2.1 不同林龄木麻黄不同部位浸提液中GC-MS分析结果

对不同林龄木麻黄不同部位浸提液（正己烷、甲醇萃取）总离子流图（图略）中的各色谱峰通过计算机自动在Willey等质谱数据库中查找，对混合物中的组分进行了鉴定和峰面积归一化计算各组分相对百分含量。

2.1.1 不同林龄木麻黄不同部位浸提液的2种萃取液检测结果比较 本试验分别采用甲醇和正己烷有机溶剂进行萃取，通过对GC-MS的结果鉴定分析，由2种萃取液处理后检出100多种物质，除去一些烷类后相对含量超过0.1%的物质如表1～表6所示。其中酯类检测出14种，酮类检测出11种，酚类检测出6种，酸类检测出3种，醇类检测出8种，还有一些吡啶、烯烃等物质。其中采用正己烷进行萃取得到的物质种类与含量比用甲醇萃取要少。由甲醇作为萃取液检测出的物质多为酮类、醇类、酚类，正己烷萃取液中检测出的物质多为烷类、醇类。

表1 不同林龄木麻黄根的正己烷萃取液中检测出物质的相对含量Table 1 The n-hexane extraction of roots of the C.equisetifolia with different ages %

表2 不同林龄木麻黄根的甲醇萃取液中检测出物质的相对含量Table 2 The methanol extract of roots of the C.equisetifolia with different ages %

2.2 不同林龄木麻黄不同部位浸提液中共有物质的分析

表3 不同林龄木麻黄凋落物的正己烷萃取液中检测出物质的相对含量Table 3 The n-hexane extract of litter under the C.equisetifolia with different ages %

除酚类和醇类，试验结果表明在不同林龄木麻黄的部分样品中检测出一定含量的3，5-二羟基-4，7-二甲氧基黄酮、7，9-二叔丁基-1-氧杂螺（4，5）癸-6，9-二烯-2，8-二酮、棕榈酸甲酯、硬脂酸甲酯、二苯砜。

表4 不同林龄木麻黄凋落物的甲醇萃取液中检测出物质的相对含量Table 4 The methanol extract of litter under the C.equisetifolia with different ages %

表5 不同林龄木麻黄土壤的正己烷萃取液中检测出物质的相对含量Table 5 The n-hexane extract of soil under the C.equisetifolia with different ages %

表6 不同林龄木麻黄土壤的甲醇萃取液中检测出物质的相对含量Table 6 The methanol extract of soil under the C.equisetifolia with different ages %

2.3 不同林龄木麻黄不同部位浸提液中特有物质的分析

在不同林龄木麻黄样品中鉴定出的特有物质主要有52种。在木麻黄的根系及凋落物中均鉴定出25种，其中根系样品中相对含量较高的主要有9，9，10-三甲基-9，10-二氢蒽、2-（苯基乙炔基）-吡啶、4-丁氧-1-正丁醇、2-三甲基硅基-1，3-二噻吩等。这几种物质皆在中龄林中检测到，产生这种现象可能与植物体内物质的转化以及中龄林中特有微生物的作用有关。木麻黄凋落物样品中相对含量较高的主要有2-丙基十一烷基亚硫酸酯、蒽，9，10-二氢9，9，10三甲基、吡啶、己二酸二辛酯等。木麻黄土壤样品中检测出2种，分别为（Z）-4-硝基-α-（对硝基苯基）肉桂酸和β-甲基d-呋喃糖苷。

3 结论与讨论

GC-MS技术应用广泛，具有需样量小、灵敏度高，能对待测组分的功能团进行有效鉴定等优点。李艳宾等利用气相色谱-质谱（GC-MS）联用技术分析出棉秆腐解物的化感成分［12］。曾任森等经运用GC-MS测定出蜂蟆菊中的5，22-二烯-3-豆甾醇乙酸脂、十六烯酸甲酯和十八烯酸甲酯3个化合物的混合物，并鉴定其具有较弱的化感作用［13］。本文通过GC-MS技术对不同林龄木麻黄的水浸提液进行鉴定分析，检测出酸、酯、烷、醛、酮、酰胺及酚类等有机化合物。对这些化合物进行整理分析，发现不同林龄木麻黄浸提液中共有的物质有7种，主要为2，4-二叔丁基苯酚。目前，对酚酸类物质的化感作用研究较多，秦波［14］等人的研究表明2，4-二叔丁基苯酚对稗草、水稻、莴苣种子的萌发以及幼苗生长的综合抑制作用活性很强。王明道［15］等人通过GC-MS从地黄组织中分离鉴定出2，4-二叔丁基苯酚，并通过验证性试验证明该物质是地黄抑制芝麻生长发育的主要化感物质。吴凤芝［16］等通过实验发现高浓度的酚酸会破坏植物叶绿体、线粒体和细胞膜的结构，会破坏根系细胞核及贮藏组织结构。Roshchi-na［17］等人研究报道一些多酚类化合物能抑制受体植物SOD和CAT酶活性，导致体内活性氧增多，启动膜脂过氧化，进而产生化感作用，抑制植物对养分的吸收。除2，4-二叔丁基苯酚外，还检测出醇类、酮类及酯类等6种共有物质。而不同林龄木麻黄浸提液中特有的物质检测出52种（根系中含有25种、土壤中含有2种、凋落物中含有25种）。

从不同林龄不同部位的浸提液中物质的种类数量和其相对百分含量来看，中龄林木麻黄凋落物中检测出物质最为丰富，而在木麻黄中龄林的其他部位浸提液中物质种类也是相对比较多的。这些物质的相对含量较高，说明可能对木麻黄的自身生长和代谢密切相关，可能是影响其衰退的潜在因素。它们的相对含量在不同林龄不同部位的浸提液中是变化的，这与物质分泌途径、微生物作用以及木麻黄自身生长需要有关，其中微生物的作用是非常重要的。李小容［8］等对海南岛不同林龄的木麻黄林地土壤微生物的功能多样性进行研究，发现其多样性是随林龄的增加而增高的。而不同林龄木麻黄林地的土壤具有特有的微生物，这也是不同林龄木麻黄林地土壤中检测出物质的种类和相对含量差别的原来之一。

目前研究数据显示，3种林龄木麻黄根系、根际土壤，凋落物的水浸提液中检测到的物质已有部分有报道其对植物生长有一定的化感效应，而有部分物质尚未见报道，但是这几十种物质究竟是否对木麻黄产生自毒作用和作用机理尚待进一步研究。

［1］ 陈小勇，林鹏.我国木麻黄林的衰退现象及其成因［J］.福建环境，1997，1（45）：37-39.

［2］ 刘旷勋，郝清玉，钟琼芯.海南省文昌与万宁沿海防护林质量调查与对比分析［J］.防护林科技，2009（5）：12-16.LIU K X，HAO Q Y，ZHONG Q X.Investigation and comparative anlysis on coastal shelterbelt of Wenchang and Wanning in Hainan Province［J］.Protection Forest Science and Technology，2009（5）：12-16.（in Chinese）

［3］ 林武星，洪伟，叶功富.木麻黄水浸液对其幼苗生长的影响［J］.江西农业大学学报，2005，27（1）：46-51.LIN W X，HONG W，YE G F.Effects of water extract from Casuarina equisetifolia on its seedling griwth［J］.Acta Agriculturae Universitatis Jiangxiensis，2005，27（1）：46-51.（in Chinese）

［4］ 林武星.自身他感作用物对木麻黄幼苗叶绿素及糖类的影响［J］.浙江林学院学报，2007，24（1）：12-16.LIN W X.Self-Allelopathy from root solutions on chlorophyll and carbohydrate of Casuarina equisetifolia seedlings［J］.Journal of Zhejiang Forestry College，2007，24（1）：12-16.（in Chinese）

［5］ 林武星.自身它感作用物对木麻黄苗木活性氧代谢影响［J］.福建农业学报，2010，25（1）：108-113.LIN W X.Effect of Self-Allelopathy on AOS of Casuarina equisetifolia forst seedling［J］.Fujian Journal of Agricultural Sciences，2010，25（1）：108-113.（in Chinese）

［6］ 李小容，李蕾.植物化感物质与土壤微生物的研究进展［J］.广东农业科学，2013（12）：178-181.LI X R，LI L.Review of the advances on plant Allelochemicals and soil microorganisms［J］.Guangdong Agricultural Sciences，2013（12）：178-181.（in Chinese）

［7］ 李小容，李蕾，韦金玉，等.海南岛不同林龄的木麻黄林地土壤微生物的功能多样性［J］.植物生态学报，2014，38（6）：608-618.LI X R，LI L，WEI J Y，et al.Functional diversity of soil microorganisms in Casuarina equisetifolia woodlands of different stand ages in Hainan Island［J］.Chinese Journal of Plant E-cology，2014，38（6）：608-618.（in Chinese）

［8］ 李小容，李蕾，白礼姣，等.不同林龄木麻黄林地土壤理化性质与生化活性分析［J］.西北林学院学报，2014，29（2）：37-41.LI X R，LI L，BAI L J，et al.Analysis of soil physicochemical properties and biological activity of the Casuarina equisetifolia forests with diffetent ages［J］.Journal of Northwest Forestry University，2014，29（2）：37-41.（in Chinese）

［9］ 王春晴，李蕾，刘强.木麻黄乙醚浸提液的分离及鉴定［J］.林业科技，2011，36（1）：30-33.

［10］ 王春晴，刘强，李蕾，等.木麻黄水浸提液对青皮种子的化感效应［J］.西北林学院学报，2012，27（3）：80-86.WANG C Q，LIU Q，LI L，et al.Isolation and identification of the aqueous extract from Casuarina equisetifolia and Al-lelopathy of Vatica mangachapoi［J］.Journal of Northwest Forestry University，2012，27（3）：80-86.（in Chinese）

［11］ 王春晴，刘强，李蕾，等.木麻黄浸提液对青皮苗光合特性的影响［J］.西北林学院学报，2012，27（4）：31-38.WANG C Q，LIU Q，LI L，et al.Effect of Casuarina equisetifoliaextract on the photosynthetic characteristics of Vatica mangachapoi seedings［J］.Journal of Northwest Forestry University，2012，27（4）：31-38.（in Chinese）

［12］ 李艳宾，张琴，万传星，等.棉秆腐解物的化感作用及其主要化学成分分析［J］.棉花学报，2009，21（6）：497-502.

［13］ 曾任森，林象联，骆世明，等.蜂蟆菊的生化他感作用及生化他感作用物的分离鉴定［J］.生态学报，1996，16（1）：20-27.

［14］ 秦波，张晓影，王朋.稗草潜在化感物质的排查［J］.生态学杂志，2011，30（10）：224-229.QIN B，ZHANG X Y，WANG P.Potential Allelochemicals in barnyard grass［J］.Chinese Journal of Ecology，2011，30（10）：224-229.（in Chinses）

［15］ 王明道，陈红歌，贾新成，等.地黄对芝麻的化感作用及其化感物质的分离鉴定［J］.植物生态学报，2009，33（6）：1191-1198.WANG M D，CHEN H G，JIA X C，et al.Isolation and identification of Allelochemicals from Rehmannal glutinosa that affect Sesamum indicum［J］.Chinese Journal of Plant E-cology，2009，33（6）：1191-1198.（in Chinese）

［16］ 吴凤芝.外源酚酸对黄瓜自毒作用的生理生化机制研究［D］.哈尔滨：东北农业大学，2002.

［17］ ROSHCHINA V V，ROSHCHINA V D.The excretory function of higher plant［M］.New York：Spinger-verlag，1993：213-215.