内吗啡肽在大鼠视网膜上的表达

张乐石 李志方 刘力学 薛伟宁 樊双义

基础研究论著

内吗啡肽在大鼠视网膜上的表达

张乐石 李志方 刘力学 薛伟宁 樊双义

目的 探讨内吗啡肽在视网膜的分布，内吗啡肽和μ阿片受体在视网膜的共存关系。方法 成年雄性SD大鼠12只，分为2组，一组为正常对照组（n＝6），另一组建立高眼压模型（高眼压模型组，n＝6）。运用免疫组织化学方法观察内吗啡肽1（EM-1）、内吗啡肽2（EM-2）和μ阿片受体在视网膜中的分布和共存，并利用高眼压模型观察高眼压对EM-2在视网膜表达的影响。结果视网膜无EM-1分布；EM-2主要分布于视网膜节细胞层；EM-2与NeuN、μ阿片受体在视网膜节细胞层共存；高眼压模型大鼠视网膜节细胞层内单位面积表达EM-2的细胞数明显少于正常大鼠（0.8± 0.1个／mm3vs.4.6±0.8个／mm3），差异有统计学意义（t＝3.88，P＜0.05）。结论 EM-2分布在视网膜节细胞层，与μ阿片受体共存，在高眼压状态下，EM-2的表达减少。

内吗啡肽；视网膜；高眼压；分布

内吗啡肽是内源性阿片肽家族的一个成员，是1997年Zadina等［1］在牛脑中发现，对μ阿片受体具有高选择性的、强效的内源性配体。内吗啡肽是一个四肽，氨基酸残基序列为Tyr-Pro-Trp-Phe-NH2 或Tyr-Pro-Phe-Phe-NH2，分别命名为内吗啡肽1 （EM-1）和内吗啡肽2（EM-2）［2］。内吗啡肽在镇痛、心血管功能调节、呼吸功能调节以及消化功能调节都具有一定的作用，近期有文献报道在肠神经系统中发现内吗啡肽能神经元的分布，但内吗啡肽在视网膜的分布尚未见报道。脊椎动物的视网膜是一个复杂的、具有重要感知功能的组织，钙结合蛋白D-28k、钙视网膜蛋白、一氧化氮合酶等表达于哺乳动物视网膜，近期有文献报道内源性阿片肽家族的另一成员——脑啡肽在视网膜有表达，并与感光关系密切［3］。本文拟研究内吗啡肽在视网膜的分布，现将结果报告如下。

材料与方法

一、材料

成年雄性SD大鼠12只，购自第四军医大学实验动物中心，分为2组，每组6只大鼠，一组为正常对照组，另一组建立高眼压模型。药品与试剂：兔抗EM-1多克隆抗体（1∶200 Abcam）；兔抗EM-2多克隆抗体（1∶200 Abcam）；小鼠抗NeuN多克隆抗体（1∶500 millipore）；生物素标记的驴抗兔多克隆抗体（1∶500 chemion）；Alexa594标记的羊抗小鼠多克隆抗体（1∶500 Invitrogen）；FITC标记的生物素（1∶1 000 Vector）。

二、方法

1.麻醉及高眼压模型建立

大鼠经7%水合氯醛（0.4 ml／kg）腹腔注射麻醉后，俯卧位固定在手术台上，利多卡因滴眼。以一次性输液器连接4.5号针头经角膜缘刺入前房，接500 ml生理盐水，距大鼠垂直距离为1.5 m，保持60 min。右眼以针头刺穿行假手术。7 d后处死取材。

2.取 材

25%乌拉坦（1ml／kg）腹腔注射麻醉，开胸经左心室穿刺入升主动脉，先灌入200 ml 0.01 mol／L PBS冲净血液，再用含4%多聚甲醛的磷酸缓冲液（PB）500 ml灌注固定，取双侧眼球，放入上述溶液后固定24 h。

3.染 色

用恒冷箱切片机对眼球进行冠状位冰冻切片，片厚12 μm，隔2张取1张，切片立即贴于经载胶处理的载玻片上。第1组第1套切片用于EM-1／EM-2单标记的免疫组织化学染色，步骤如下：①兔抗EM-1多克隆抗体（1∶200 Abcam）／兔抗EM-2多克隆抗体（1∶200 Abcam）4℃孵育72h；②加入Biotin标记的驴抗兔多克隆抗体（1∶200，Millipore），室温孵育4 h；③加入ABC复合物（1∶200，Vector），室温孵育2 h，DAB呈色10 min。将经过上述处理的切片室温干燥后用中性树胶封片，使用明视野显微镜观察。

第1组第2套、第2组第1套切片用于EM-2／MOR双标的免疫荧光组织化学染色，步骤如下：①兔抗EM-2多克隆抗体＋小鼠抗MOR（1∶200，Abcam）4℃孵育72 h；②生物素标记的驴抗兔多克隆抗体（1∶500 chemion）＋Alexa594标记的羊抗小鼠多克隆抗体（1∶500 Invitrogen），室温孵育4 h；③FITC标记的生物素（1∶1 000 Vector），室温孵育2 h。

第1组第3套、第2组第2套切片用于EM-2／NeuN双标的免疫荧光组织化学染色，步骤如下：①兔抗EM-2多克隆抗体＋小鼠抗NeuN多克隆抗体（1∶500，Millipore）4℃孵育72 h；②生物素标记的驴抗兔多克隆抗体（1∶500 chemion）＋Alexa594标记的羊抗小鼠多克隆抗体（1∶500 Invitrogen），室温孵育4 h；③FITC标记的生物素（1∶1 000 Vector），室温孵育2 h。

上述各步骤之间均用0.01 mol／L的PBS （pH7.3）洗片3次，每次10 min。所有上述一抗和二抗均用含5%驴血清、0.3%Triton X2100、0.25%角叉菜胶和0.05%叠氮化钠的0.01 mol／L PBS（pH7.3）稀释。将经过上述处理的切片经室温干燥，以2.5%三乙烯二胺和等量甘油的混合液封片，激光扫描共聚焦显微镜（FV1000，Olympus）观察。同时以正常羊血清代替一抗孵育第2套切片，其余染色步骤与上相同进行阴性对照实验，结果均为阴性。

4.细胞计数

每个标本取5个独立视野（×600），计算每个独立视野内的阳性细胞数，取平均值作为该标本单位面积内的阳性细胞数。

三、统计学处理

采用SPSS 12.0统计学软件对数据进行统计分析，计量资料以±s表示，组间比较采用独立样本t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

结 果

一、内吗啡肽在正常大鼠视网膜上的分布

免疫组织化学染色显示，未见EM-1阳性产物在视网膜上的分布（图1A，×20），EM-2阳性产物分布在视网膜节细胞层（GCL）神经细胞胞体［图1 B（×20）、C（×100）］，且EM-2与NeuN（图2）、μ阿片受体（图3）在视网膜上的共存。

二、内吗啡肽在高眼压模型大鼠视网膜上的分布

对大鼠眼前房行高眼压处理后，视网膜节细胞层水肿且结构松散，行NeuN染色见神经细胞数量无明显减少，而在EM-2在视网膜节细胞层的表达减少（图4）。正常大鼠视网膜节细胞层单位面积EM-2阳性细胞数平均为4.6±0.8个／mm3，高眼压模型大鼠视网膜节细胞层单位面积EM-2阳性细胞数平均为0.8±0.1个／mm3（表1）。高眼压模型大鼠视网膜节细胞层内单位面积表达EM-2的细胞数明显少于正常大鼠，差异有统计学意义（t＝3.88，P＜0.05）。

图1 EM-1、EM-2阳性产物在小鼠视网膜上的分布

图2 EM-2免疫阳性产物与NeuN在小鼠视网膜节细胞层的共存

表1 高眼压组和正常对照组视网膜节细胞层EM-2阳性细胞数（±s，n＝6）

表1 高眼压组和正常对照组视网膜节细胞层EM-2阳性细胞数（±s，n＝6）

组 别大鼠1大鼠2大鼠3大鼠4大鼠5大鼠6高眼压组0.6±0.10.2±0.11.3±0.20.7±0.10.8±0.21.2±0.1正常对照组7.2±1.23.9±0.85.4±0.55.0±1.52.2±0.33.9±0.6

图3 EM-2免疫阳性产物与μ阿片受体在小鼠视网膜节细胞层的共存

图4 高眼压处理后7 d的小鼠视网膜节细胞层

讨 论

内吗啡肽主要分布在中枢神经系统，与μ阿片受体分布相似，但EM-1和EM-2的分布并不相同。EM-1在脑部的分布比EM-2密集而广泛，主要分布于孤束核、臂旁核、隔区、斜角带、终纹床核、缰核、丘脑腹后内侧核、下丘脑后核、导水管周围灰质（PAG）、蓝斑、伏核、杏仁核及运动性语言中枢等部位；EM-2在脊髓的分布比EM-1更为广泛，主要分布于脊髓背角的小直径初级传入神经、脊髓背角浅神经层、背根及三叉神经脊束核。它也出现于脑中富有阿片受体的区域：伏核、丘脑中央中核、隔区、下丘脑和杏仁核、蓝斑和PAG，但在大脑皮质、纹状体、海马、孤束核和背根神经节上分布很少［4］。EM-2样免疫反应纤维和膨体在脊髓胶状质和边缘系统的分布与脑啡肽、强啡肽相似，与P物质则共存于三叉神经脊束核，从而提示它在痛觉调节中起重要作用［5］。EM-1及EM-2于在体实验中均表现出较强的镇痛作用［6］。

研究结果显示，在视网膜上只有EM-2表达，无EM-1表达，EM-2阳性神经元分布在节细胞层，且与神经元特异性标记NeuN及μ阿片受体共存。视网膜内的细胞根据其形态、功能不同，分为无长突细胞、水平细胞、双极细胞、节细胞、感光细胞等。根据视网膜内EM-2阳性神经元的形态可判定其属于节细胞。

在高眼压模型大鼠视网膜上，EM-2阳性细胞的表达明显减少，提示EM-2在青光眼的发生发展中起到一定的作用。

致视网膜损伤的病理基础是视网膜节细胞的进行性死亡。临床研究结果证实，尽管许多青光眼患者的眼压已得到控制，但视野和视神经损害仍继续发展，有时将导致视力完全丧失［7］。既往研究显示，内源性阿片肽对神经细胞、心肌缺血具有保护作用，当心肌缺血时，心脏通过自身分泌或者旁分泌内源性阿片肽，并作用于心肌上的阿片受体，发挥重要的心肌保护作用［8-9］。阿片受体激动剂通过改善神经细胞供血、减轻细胞水肿、降低TNF-α表达、减轻炎症反应等途径起到缺血保护作用［10-11］。内源性阿片肽可激活磷酸肌醇3-激酶通路、减少氧自由基形成、抑制神经细胞凋亡［12］。而在高眼压模型上视网膜节细胞层的EM-2表达减少，提示内源性阿片肽在视网膜上可能起到缺血保护的作用，EM-2的表达减少是高眼压造成视网膜持续性损害的可能机制。进行外源性阿片肽预处理可能能够减轻高眼压对视网膜的持续损害，但需要进一步研究证明。

［1］Zadina JE，Hackler L，Ge LJ，et al.A potent and selective endogenous agonist for the mu-opiate receptor. Nature，1997，386：499-502.

［2］Gong J，Strong JA，Zhang S，et al.Endomorphins fully activate a cloned human mu opioid receptor.FEBS Lett，1998，439：152-156.

［3］韩蕊，黄静，陈晶，等.ENK与CaBPs在PPE-GFP转基因小鼠视网膜细胞中的共存.神经解剖学杂志，2010，26：37-41.

［4］Schreff M，Schulz S，Wiborny D，et al.Immunofluorescent identification of endomorphin-2-containing nerve fibers and terminals in the rat brain and spinal cord.Neuroreport，1998，9：1031-1034.

［5］Moody TW，Miller MJ，Mártinez A，et al.Adrenomedullin binds with high affinity，elevates cyclic AMP，and stimulates c-fos mRNA in C6 glioma cells. Peptides，1997，18：1111-1115.

［6］Tseng LF，Narita M，Suganuma C，et al.Differential antinociceptive effects of endomorphin-1 and endomorphin-2 in the mouse.J Pharmacol Exp Ther，2000，292：576-583.

［7］Liu Y，Allingham RR.Molecular genetics in glaucoma. Exp Eye Res，2011，93：331-339.

［8］Chaturvedi K，Christoffers KH，Singh K，et al.Structure and regulation of opioid receptors.Biopolymers，2000，55：334-346.

［9］Tanaka K，Kersten JR，Riess ML.Opioid-induced cardioprotection.CurrPharmDes，2014，20：5696-5705.

［10］Chi OZ，Hunter C，Liu X，et al.Effects of fentanyl pretreatment on regional cerebral blood flow in focal cerebral ischemia in rats.Pharmacology，2010，85：153-157.

［11］Jeong S，Kim SJ，Jeong C，et al.Neuroprotective effects of remifentanil against transient focal cerebral ischemia in rats.J Neurosurg Anesthesiol，2012，24：51-57.

［12］Pateliya BB，Singh N，Jaggi AS.Possible role of opioids and KATP channels in neuroprotective effect of postconditioning in mice.Biol Pharm Bull，2008，31：1755-1760.

Expression of endomorphins in the retina of rat

Zhang Leshi，Li Zhifang，Liu Lixue，Xue Weining，Fan Shuangyi.Department of Neurology，Affiliated Hospital of Military Medical Sciences，Beijing 100071，China Corresponding author，Zhang Leshi，E-mail：zlsfmmu＠163.com

Objective To investigate the distribution of endomorphins（EM）in the retina，and assess the coexistence of EM and μ-opioid receptor in the retina.Methods Twelve Sprague Dawley（SD）rats were divided into the control（n＝6）and intraocular hypertension model groups（n＝6）.Immunohistochemistry was used to detect the expression and coexistence of EM-1，EM-2 and μ-opioid receptor in the rat retina，and evaluate the influence of intraocular hypertension upon the expression of EM-2.Results EM-1 was not expressed in the retina.EM-2 was mainly distributed in the retinal ganglion cell layer.EM-2，NeuN and μopioid receptor coexisted in the retinal ganglion cell layer.The density of cells expressing EM-2 in the intraocular hypertension model group was（0.8±0.1）／mm3，significantly lower compared with（4.6±0.8）／mm3in the control group（t＝3.88，P＜0.05）.Conclusions EM-2 was expressed in the retinal ganglion cell layer and coexisted with μ-opioid receptor.The expression of EM-2 was decreased under intraocular hypertension.

Endomorphins；Retina；Intraocular hypertension；Distribution

2014-12-11）

（本文编辑：杨江瑜）

10.3969／g.issn.0253-9802.2015.04.005

100071北京，军事医学科学院附属医院神经内科

，张乐石，E-mail：zlsfmmu＠163.com