高效液相色谱法同时测定饲料添加剂中6种有机酸含量

赵 艳 张凤枰 杨发树 刘耀敏

（水产畜禽营养与健康养殖农业部重点实验室通威股份有限公司，成都 610041）

高效液相色谱法同时测定饲料添加剂中6种有机酸含量

赵 艳 张凤枰 杨发树 刘耀敏

（水产畜禽营养与健康养殖农业部重点实验室通威股份有限公司，成都 610041）

建立高效液相色谱法同时分离测定饲料添加剂中的甲酸、乳酸、乙酸、柠檬酸、丙酸、苯甲酸含量的方法。样品用盐酸溶液（0.1%）∶乙腈（1∶1）超声提取，应用ZORBAX SB-C18色谱柱，以乙腈和盐酸溶液（0.1%）为流动相进行梯度洗脱，紫外检测器在210 nm处进行检测，外标法定量。结果表明，6种有机酸线性关系良好，相关系数均为0.999 9，回收率96.5%～103.2%，变异系数0.94%～4.15%，甲酸、乳酸、乙酸、柠檬酸、丙酸、苯甲酸检出限分别为检出限分别为0.1、1.0、1.0、0.5、0.5、0.02μg／mL。该方法操作简便、灵敏度高、重现性好，适用于饲料添加剂中6种有机酸含量的测定。

高效液相色谱法 饲料添加剂 有机酸

饲料添加剂中的有机酸主要有可以降低饲料和胃肠道的pH值，抑制有害菌，促进有益菌的生长繁殖，促进酶原的活化、提高酶的活性、促进动物对营养物质的消化和吸收等作用，因此，饲料中有机酸主要作为饲料的酸味剂被广泛使用。目前，有机酸测定的方法有气相色谱法［1-2］、气质联用法［3-4］、离子色谱法［5-8］、毛细管电泳法［9-11］、高效液相色谱法［12-15］等。气相色谱法和气质联用法虽具有较强的专属性，但其只能适用于少数低沸点有机酸含量的测定，且仪器维护成本较高。高效液相色谱法是目前有机酸分析的常用液相色谱方法，其特异性强、准确度高，可用于多种有机酸的同时分离检测。利用HPLC测定有机酸大多是关于发酵产品［13］、食品［14］、饮料［15］等，而利用高效液相色谱对饲料添加剂中的甲酸、乳酸、乙酸、柠檬酸、丙酸、苯甲酸含量的同时测定方法鲜见报道。本研究在大量试验基础上，建立了饲料添加剂中6种有机酸的高效液相色谱同时测定的方法。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

Alliance 2695高效液相色谱仪，2487紫外检测器，ENPOWER色谱管理系统：美国 Waters公司；KQ5200B型超声波清洗器：昆山市超声仪器有限公司。

甲酸、乳酸、乙酸、柠檬酸、丙酸、苯甲酸对照品：美国Sigma-Aldrich公司；盐酸（优级纯）：四川西陇化工有限公司；乙腈 （色谱纯）：美国Fisher公司；水为Milli-Q Gradient超纯水。

饲料酸化剂样品：市售。

1.2 标准溶液和提取溶液的配制

精密称取甲酸、乳酸、乙酸、柠檬酸、丙酸对照品各1.000 0 g，置100 mL棕色量瓶中，加盐酸溶液（0.1%）适量溶解后稀释至刻度，分别得到浓度为10 mg／mL的储备液；准确称取苯甲酸对照品约0.040 0 g，置于100 mL棕色量瓶中，加盐酸溶液（0.1%）∶乙腈（1∶1）适量溶解后稀释至刻度，得到浓度为0.4 mg／mL的储备液。根据需要稀释成系列标准溶液。

1.3 HPLC分析条件

色谱柱：ZORBAX SB-C18色谱柱，150×4.6 mm，5μm；流速：0.8 mL／min；柱温：30℃；检测器：紫外检测器，波长为210 nm；进样体积：20μL。流动相A：乙腈，流动相B：盐酸溶液（0.1%）；梯度洗脱条件见表1。

表1 梯度洗脱条件

1.4 供试样品溶液的制备

称取0.5 g（精确至0.000 1 g）酸化剂于100 mL的棕色容量瓶中，加入盐酸溶液（0.1%）∶乙腈（1∶1）适量，超声溶解20 min，定容至刻度，取上清液经微孔膜（0.22μm）过滤，滤液供HPLC分析。

2 结果与讨论

2.1 色谱条件的优化

采用Waters2695高效液相色谱仪，比较了常规C18柱和SB-C18柱对6种有机酸的分离效果，发现常规C18柱不能很好地分离乳酸和乙酸，而使用SB-C18（适用于较低pH值的流动相）柱可取得了良好的分离效果，6种有机酸标准谱图见图1。

图1 6种有机酸的标准溶液色谱图

在反相色谱分离过程中，有机酸分子直接在两相中分配，各种有机酸因分配系数不同而被分离。为使有机酸尽可能以分子形式存在，一般使用酸性流动相来抑制有机酸的解离，本试验以盐酸溶液和磷酸溶液为流动相做比较，发现磷酸溶液为流动相时，峰形拖尾，而以0.1%的盐酸为流动相峰形对称。

另外还考察了流速分别为 0.6、0.7、0.8、1.0 mL／min时对各有机酸分离的影响，发现流速为1.0 mL／min时乙酸和乳酸不能完全分离；当流速为0.6、0.7 mL／min时，5种有机酸全部出峰，但分析时间过长；流速为0.8 mL／min时，25 min内色谱分析完成，且各目标物质能得到完全分离。所以选择流速为0.8 mL／min。

2.2 线性关系和检出限

分别取一定量的甲酸、乳酸、乙酸、柠檬酸、丙酸、苯甲酸储备液配制成甲酸、乳酸、乙酸、柠檬酸、丙酸浓度均为10、50、100、300、500、1 000μg／mL，苯甲酸浓度为 0.4、2、4、12、20、40μg／mL的系列标准工作溶液。按照2.1色谱条件进样，以峰面积对浓度绘制标准曲线。以3倍信噪比计算检出限，以10倍信噪比计算定量限，见表2。

表2 6种有机酸的回归方程、检出限和定量限

2.3 精密度、稳定性和回收率试验

取标准工作溶液，按照1.3分析条件，连续进样6次，甲酸、乳酸、乙酸、柠檬酸、丙酸、苯甲酸的保留时间RSD分别为0.02%、0.03%、0.02%、0.05%、0.02%、0.02%；峰面积RSD分别为0.12%、0.08%、0.15%、0.06%、0.30%、0.12%，说明仪器精密度良好。

取加标样品溶液，在室温下避光放置1、2、4、8 h后进样，甲酸、乳酸、乙酸、柠檬酸、丙酸、苯甲酸峰面积的 RSD分别为 0.53%、0.81%、0.69%、0.97%、0.88%、0.52%。试验结果表明，样品溶液中6种有机酸在8 h内稳定，为保证测定结果的准确性，样品制备后应立即上机测定。

为了研究方法的可靠性，取样品0.5 g，添加2个浓度水平的标准溶液，每水平3个平行样，按照1.4供试品溶液制备方法进行处理，按照1.3仪器条件进行测定，回收率结果见表3。结果显示，6种有机酸的回收率为96.5%～103.2%，变异系数为0.94%～4.15%，符合试验要求。

表3 6种有机酸的回收率和测定的相对标准偏差（n＝3）

2.4 酸化剂样品的测定

对酸化剂样品进行定性与定量测定，见表4。

表4 样品的定量分析结果，n＝3）

表4 样品的定量分析结果，n＝3）

样品质量分数／%甲酸 乳酸 乙酸 柠檬酸 丙酸 苯甲酸1 15.0±1.32未检出 未检出 未检出19.7±0.04 6.17±0.25 2 5.35±1.03 17.8±0.38未检出 24.6±0.57未检出 未检出

3 结论

利用高效液相色谱法测定饲用酸化剂中有机酸的含量，方法简便快速、重现性好、分离效果良好、灵敏度高、检测结果可信度高，可以满足饲用酸化剂中有机酸质量控制检测需要。

［1］任清.衍生化-毛细管气相色谱法同时测定饲料添加剂中富马酸、乳酸和柠檬酸［J］.分析化学，2002，30（3）：304-306

［2］Silva F O，Ferraz V.Microwave-assisted preparation of sugars and organic acids for simultaneous determination in citric fruits by gas chromatography［J］.Food Chemistry，2004，88（4）：609-612

［3］Sun SH，Xie J P，Xie F W，et al.Determination of volatile organic acids in oriental tobacco by needle-based derivatization headspace liquid-phase microextraction coupled to gas chromatography／mass spectrometry［J］.Journal of Chromatography A，2008，1179（2）：89-95

［4］Jurado-Sánchez B，Ballesteros E，Gallego M.Gas chromatographic determination of 29 organic acids in foodstuffs after continuous solid-phase extraction［J］.Talanta，2011，84（3）：924-930

［5］刘霞，郑婷，施超欧，等.离子色谱法测定饲料添加剂中有机酸和无机酸含量［J］.中国饲料，2009（8）：39-41

［6］Ding M Y，Chen PR，Luo GA.Simultaneous determination of organic acids and inorganic anions in tea by ion chromatography［J］.Journal of Chromatography A，1997，764（2）：341-345

［7］Alcázar A，Fernández-Cáceres P L，MartıX0301 N M J，etal.Ion chromatographic determination of some organic acids，chloride and phosphate in coffee and tea［J］.Talanta，2003，61（2）：95-101

［8］Yoshikawa K，Miho Okamura，Inokuchi M，etal.Ion chromatographic determination of organic acids in food samples using a permanent coating graphite carbon column［J］.Talanta，2007，72（1）：305-309

［9］Izco JM，Tormo M，Jiménez-Flores R.Rapid Simultaneous Determination of Organic Acids，Free Amino Acids，and Lactose in Cheese by Capillary Electrophoresis［J］.Journal of Dairy Science，2002，85（9）：2122-2129

［10］Mato I，Huidobro J F，Simal-Lozano J，etal.Simultaneous determination of organic acids in beverages by capillary zone electrophoresis［J］.Analytica Chimica Acta，2006，565（2）：190-197

［11］Tang Y J，Wu M J.The simultaneous separation and determination of five organic acids in food by capillary electrophoresis［J］.Food Chemistry，2007，103（1）：243-248

［12］雷萍，黄志英.高效液相色谱法检测分析饲料有机酸化剂中甲酸和丙酸的含量［J］.饲料工业，2010，31（6）：54-55

［13］马瑞，欧阳嘉，李鑫，等.高效液相色谱法同时测定生物质乳酸发酵液中有机酸及糖类化合物［J］.色谱，2012，30（1）：62-66

［14］朱晓玲，叶飞，杨洁，等.固相萃取-高效液相色谱法测定蜂蜜中的有机酸［J］.色谱，2010，28（10）：945-949

［15］杨东伟，李晓静，王芬，等.高效液相色谱法测定葡萄酒中11种有机酸含量［J］.安徽农业科学，2013，41（3）：1286-1287.

Simultaneous Determination of Six Kinds of Organic Acids in Feed Additives by High Performance Liquid Chromatography

Zhao Yan Zhang Fengping Yang Fashu Liu Yaomin

（Key Laboratory of Aquatic，Livestock，Poultry Nutrition and Healthy Culturing，Ministry of Agriculture，Tongwei Co.，Ltd.，Chengdu 610041）

A method was established for the simultaneous determination of formic acid，lactic acid，acetic acid，citric acid，propanoic acid and benzoic acid in feed additives by high performance liquid chromatography.Analytes were extracted with hydrochloric acid solution（0.1%）：acetonitrile（1∶1）.Separation and quantification were achieved by using a ZORBAX SB-C18 column，and a mobile phase of acetonitrile-hydrochloric acid solution（0.1%）was used for gradient elution.The detection wavelength was 210 nm.The external standard method was used for quantification.There was a good linear relationship for six organic acids（correlation coefficient is0.999 9）.Average spike recovery of six organic acids was 96.5%～103.2%，with variable coefficient of 0.94%～4.15%，the limit of detection for formic acid，lactic acid，acetic acid，citric acid，propanoic acid and benzoic acid being 0.1，1.0，1.0，0.5，0.5 and 0.02μg／mL respectively.This method is simple，sensitive，reproducible and suitable for the determination of six organic acids in feed additives.

high performance liquid chromatography，feed additives，organic acids

O657.7

A

1003-0174（2015）02-0127-04

四川省科技支撑计划（2011NZ0071）

2013-10-14

赵艳，女，1983年出生，工程师，饲料营养及质量安全评价