上海市猪源沙门氏菌耐药性及脉冲场凝胶电泳分型研究

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（上海市动物疫病预防控制中心，上海 201103）

上海市猪源沙门氏菌耐药性及脉冲场凝胶电泳分型研究

宁 昆，张维谊，沈莉萍，徐 峰，齐新永，王 建

（上海市动物疫病预防控制中心，上海201103）

为了解上海地区猪源沙门氏菌的耐药性及基因分型情况，本研究对2013年分离到的13株猪源沙门氏菌（10株为猪霍乱沙门氏菌，3株为鼠伤寒沙门氏菌）采用微量肉汤稀释法进行药物敏感性测定，应用脉冲场凝胶电泳（PFGE）进行基因分型。药物敏感试验结果表明，分离到的13株沙门氏菌对磺胺异恶唑、多西环素、氟苯尼考和阿莫西林的耐药率较高，对阿莫西林/棒酸、头孢曲松、丁胺卡那霉素和头孢噻呋敏感。脉冲场凝胶电泳分型结果显示，10株猪霍乱沙门氏菌中有8株为流行病学相关，是本次研究中猪霍乱沙门氏菌的优势基因型。

上海；猪；沙门氏菌；耐药性；脉冲场凝胶电泳

沙门氏菌属是一群寄生于人和动物肠道内的革兰阴性杆菌，绝大多数沙门氏菌对人和动物有致病性，具有极其广泛的宿主谱，是一种重要的人畜共患病病原。不仅引致人的伤寒、副伤寒、急性胃肠炎、败血症等疾病，还侵害幼、青年动物，使之发生败血症、胃肠炎及其他组织局部炎症，对怀孕母畜可致流产，摄入沙门氏菌污染的食物可致人的急性食物中毒[1]。在目前国内的畜禽养殖条件下，抗生素滥用现象十分严重，导致细菌的耐药性不断加剧和蔓延，耐药菌株不断出现，由此带来的耐药问题、食品安全问题及公共卫生问题也越来越严重[2]。随着对细菌感染研究的日益深入，传统的细菌表型分型已不能满足疾病诊断和流行病学调查的需要，细菌分子分型正在逐渐取代传统的表型分型来分析不同来源细菌之间的联系，这对细菌的研究具有重要意义[3]。脉冲场凝胶电泳（pulsed-fi eld gel electrophoresis，PFGE）分型方法是对细菌整个染色体进行分析，具有分辨率高、重复性好、结果稳定、易于标准化的特点，被认为是细菌分子分型的金标准，目前在国内外被广泛用于传染源的追溯、传播链的确认、新的流行菌株的发现和遗传变异。本试验对2013年上海地区分离到的13株猪源沙门氏菌进行了耐药性监测，并用脉冲场凝胶电泳对其进行了基因分型和流行病学分析。

1 材料

1.1 菌株来源

2013年，从上海市动物疫病预防控制中心畜禽门诊接收的发病猪中共分离到13株沙门氏菌（表1），由本实验室完成菌株鉴定并保存

1.2 主要仪器

脉冲场凝胶电泳仪CHEF-mapper、凝胶成像系统Gel Doc XR+购自Bio-Rad公司；摇床为德国IKEA公司产品；比浊仪购自法国梅里埃公司。

1.3 主要试剂

药敏板、12mL MH肉汤管和0.45% NaCl溶液购自天津川禾医疗科技有限公司；限制性内切酶XbaⅠ购自Takara公司；PFGE专用琼脂糖Seakem Gold为LONZA公司产品；蛋白酶K、Tris-HCl、EDTA、SDS购自碧云天生物科技有限公司；TBE缓冲液购自上海索莱宝生物科技有限公司；药敏质控菌株ATCC 25922和PFGE相对分子质量标准沙门氏菌全球参考菌株H9812为本实验室保存。

表1 实验中沙门氏菌信息

2 方法

2.1 微量肉汤稀释法

2.1.1 菌液制备。用灭菌棉签取适量待测菌，悬浮于3mL0.45%NaCl溶液中，用比浊仪调整细菌浓度，使其麦氏单位达到0.48～0.52，并用ATCC 25922作为试验质控菌株。

2.1.2 菌液接种。首先从12mL肉汤管中吸取100μL加到空白对照孔，然后吸取待测菌液100μL到剩余的12mL肉汤管中，混匀，加100μL到其余各孔。同样用质控菌株操作待测菌。

2.1.3 孵育。将药敏板置于垫有湿纱布的方瓷盘内，36℃温箱孵育16～18h。

2.1.4 结果观察。在衬有黑底板的光线下观察，无细菌生长的孔内所含最低抗菌药物浓度即为最低抑菌浓度（MIC）。

2.2 PFGE方法

2.2.1 细菌处理。用灭菌棉签取适量细菌，悬浮于1mLCSB溶液中，用比浊仪调整细菌的浓度，使其麦氏单位达到4.5～5.0。

2.2.2 制备胶块。取200μL细菌悬浮液于2mL Eppendorf管中，置于37℃水浴中孵育5 min。每管加入终浓度为0.5mg/mL蛋白酶K并加入200μL已融化并在56℃水浴平衡的1%的Seakem Gold琼脂糖溶液（含1% SDS），用移液器加入胶块制备模具。

2.2.3 细菌裂解。在50mL的离心管中加入5mL的CLB，然后再加入25μL浓度为20mg/mL蛋白酶K，从模具中取出细菌包埋胶块放入到离心管中，55 ℃摇床中孵育6h，摇床转速为170r/min。

2.2.4 洗涤胶块。倒掉混合液，加入15mL 50℃预热的去离子水，50 ℃摇床洗涤10min，洗涤2次，用TE缓冲液同样条件洗涤4次。

2.2.5 XbaⅠ酶切。在2mL Eppendorf管中加入200μL胶块平衡液，将洗涤过的胶块切成2mm宽的胶条，放入胶块平衡液中，37℃孵育10min，弃平衡液，加入200μL酶切溶液（175μL去离子水：20μL M Buffer：5μL XbaⅠ酶），37℃孵育12 h，弃酶切液。加入200μL 0.5×TBE电泳缓冲液平衡5min。

2.2.6 加样。第1，5，10齿各加1个H9812菌胶块作为Marker。将梳子放入胶槽，缓慢倒入100 mL在60℃水浴平衡半小时以上的1 % Seakem Gold琼脂糖溶液。

2.2.7 电泳。加2.2L 0.5×TBE电泳缓冲液，电泳时间19h，电泳温度为14℃。

2.2.8 染色。电泳后将胶放入Gelred染液中染色30min，然后用去离子水脱色1h。

2.2.9 成像及分析。用凝胶成像仪成像并将结果用BioNumerics分析软件进行分析。

3 结果

表2 药敏试验结果

图1 部分沙门氏菌的PFGE结果

3.1 药敏试验

本次试验中质控菌株及空白对照均成立，其余待测菌试验结果见表2，发现13株猪源沙门氏菌对一些抗生素耐药率较高，其中磺胺异恶唑为92.31%，多西环素为84.62%，阿莫西林为69.23%，氨苄西林为61.54%，对阿莫西林/棒酸、头孢曲松、丁胺卡那霉素和头孢噻呋敏感。

3.2 脉冲场凝胶电泳

13株沙门氏菌经XbaⅠ酶切，PFGE电泳后，每个菌株产生13到18条电泳条带，部分菌株的PFGE结果见图1。

3.3 PFGE聚类分析结果

用BioNumerics软件对13株猪源沙门氏菌进行聚类分析，结果如图2所示，10株猪霍乱沙门氏菌相似度在60%～100%，共分3个基因型，其中A型有8株（占总数的80%），其相似度在85%以上，B型1株，C型1株。Tenover认为由于细菌具有变异性，在PFGE图谱分析中，相似值在0.85以上的菌株可以判断是流行病学相关，这种方法能够用于分析菌株之间的相关性[4]。其余的3株鼠伤寒沙门氏菌带型差别较大，由于菌株数量较少，无法推测其优势基因型。

4 讨论

脉冲场凝胶电泳被认为是细菌分子分型的金标准。美国疾病预防控制中心于1996年建立了标准的PFGE方法，成立了监测食源性微生物的分子分型网络。我国疾病预防控制中心于2004年成立了中国病原菌分子分型实验室监测网络。这些监测网络对疾病的预测预警、追踪溯源等起到了很大作用[5]，国内外很多学者也进行了这方面的研究。Kubota于2005年首次在国际范围内用PFGE技术对来自31个国家地区的131株伤寒沙门氏菌进行了流行病学调查，得到了79个PFGE基因型[6]。纪惠玲试验研究了PFGE 技术在鼠伤寒沙门氏菌分型中的应用，并成功地将13株鼠伤寒沙门氏菌分为10个PFGE 基因型[7]。这些都表明PFGE分型方法已在细菌分子分型中得到广泛应用，是沙门氏菌分子流行病学较好的基因分型方法。

图2 13株猪源沙门氏菌聚类分析

细菌的PFGE基因分型按照Tenover等用相似度进行同源性分析的解释，认为相似度85%，菌株是高度同源，可能来自同一克隆株，即成流行病学相关性；相似度 50%的菌株被认为是流行病学不相关，相似度介于两者之间被认为相似菌株[4]。按照这一判定标准，本研究中的猪霍乱沙门氏菌有8株同源性在85%以上，可能来自同一克隆株，成流行病学相关性，我们定义为A带型，其数量占到总数的80%，由此我们也推测A带型可能为上海地区猪霍乱沙门氏菌的优势基因型。由于分离到的鼠伤寒沙门氏菌数量较少，从分型结果来看还不能找到优势基因型，此方面还有待进一步研究。

药敏试验结果显示，分离到的沙门氏菌耐药现象比较严重，耐药率较高的药物为磺胺异恶唑、多西环素、氟苯尼考和阿莫西林，耐药率分别达到92.31%、84.62%、76.92%和69.23%，这可能与临床药物使用不规范有关，因此在临床中应避免或减少使用已明显耐药的这几种药物。丁胺卡那霉素、头孢曲松、头孢噻呋和阿莫西林/棒酸对试验的沙门氏菌效果很好，说明在治疗上海地区猪源沙门氏菌感染时可作为首选药物。

[1] 陆承平. 兽医微生物学[M]. 北京：中国农业出版社，2013.

[2] 唐攀，崔恩慧，刘万华，等. 鸡源沙门氏菌PFGE分型及耐药性研究[J]. 动物医学进展，2013，34（11）：1-5.

[3] 陈瑞，訾占超，石佩，等. 鸡沙门氏菌脉冲场凝胶电泳分型研究[J]. 中国预防兽医学报，2009，31（11）：846-849.

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[5]陈瑞，熊惠军，宋立等. 脉冲场凝胶电泳在沙门氏菌流行病学中的应用[J]. 中国兽药杂志，2010，44（7）：37-39.

[6] Kubota K，Barrett T J，Ackers M L，et al. Analysis of Salmonella enterica Serotype Typhi Pulsed-Field Gel Electrophoresis Patterns Associated with International Travel[ J ]. J Clin M icrobiol，2005，43（3）：1205- 1209.

[7] 纪惠玲，陈艳，刘秀锋. 脉冲场凝胶电泳技术在鼠伤寒沙门氏菌分型中的应用[J]. 海峡预防医学杂志，2005，11（1）：3-5.

Research on Drug-resistance and Genotyping of Salmonella from Pig in Shanghai by Pulsed-fi eld Gel Electrophoresis

Ning Kun，Zhang Weiyi，Shen Liping，Xu Feng，Qi Xinyong，Wang Jian
（Shanghai Animal Disease Control Center，Shanghai 201103）

To investigate the drug-resistance and genotype of Salmonella from pig in Shanghai，13 Salmonella isolates（10 Salmonella choleraesuis，3 Salmonella typhimurium）were tested for their drug-resistance using broth dilution method，and genotyped by pulsed-fi eld gel electrophoresis（PFGE）. Drug-resistance test showed that the 13 Salmonella isolates were resistant to sulfisoxazole，doxycycline，florfenicol and amoxicillin，and sensitive to amoxicillin/clavulanic acid，ceftriaxone，amikacin and ceftiofur. Pulsed-fi eld gel electrophoresis typing showed that 8 Salmonella choleraesuis were epidemiologically linked，and were the dominant genotype in our study.

Shanghai；swine；Salmonella；drug-resistance；pulsed-fi eld gel electrophoresis

R378.22；S828

：A

：1005-944X（2015）02-0079-04

沪农科攻字（2011）第4-9号

王建