空肠弯曲菌致GBS动物模型的建立

薛 峰，曾德新，徐 飞，杨跃飞，王小波，张小荣，李震中，蒋 原

（1.江苏出入境检验检疫局动植物与食品检测中心，江苏南京 210001；2.扬州大学兽医学院，江苏扬州 225009；3.河北医科大学第二附属医院，河北石家庄 050000）

空肠弯曲菌致GBS动物模型的建立

薛 峰1，曾德新1，徐 飞1，杨跃飞2，王小波2，张小荣2，李震中3，蒋 原1

（1.江苏出入境检验检疫局动植物与食品检测中心，江苏南京210001；2.扬州大学兽医学院，江苏扬州225009；3.河北医科大学第二附属医院，河北石家庄050000）

[目的]利用巴马小香猪构建空肠弯曲菌致GBS的动物模型。[方法]选取致人GBS源空肠弯曲菌株，采用3×1012cfu/mL、3×1011cfu/mL、3×1010cfu/mL、3×109cfu/mL等浓度对4组巴马小型猪灌胃攻毒，每头猪攻毒10mL，同时设立对照组。从第二周开始定期采集组织样及血液样本，通过免疫学检测及组织病理切片判定病变情况。[结果]免疫学检测发现，在16份攻毒组样品中有12份血清中GM1-IgG抗体检测阳性，阳性检出率为81.25%。但是，并没有显著的攻毒浓度梯度差异。病理组织切片H/E染色显示，抗体阳性试验猪的大脑出现了噬神经元、小血管周围间隙增宽、神经中央染色溶解等现象；切片LFB染色显示，在发病模型动物的小脑白质和腰膨大出现了轻度脱髓鞘现象。[结论]结果表明空肠弯曲菌诱导GBS的浓度在3×109cfu/ mL～3×1012cfu/mL均可，组织样本及血液采集在攻毒后4～5周较理想。

空肠弯曲菌；GBS；巴马小香猪；动物模型

格林-巴利综合征（GBS）又称吉兰-巴雷综合征或急性炎症性脱髓鞘性多发性神经病（AIDP），是由体液和细胞共同介导的单向性自身免疫性周围神经病[1]。诱发GBS的因素一般为空肠弯曲菌、巨细胞病毒、EB病毒、肺炎支原体、乙型肝炎病毒、人类免疫缺陷性病毒等，其中最常见的是空肠弯曲菌，达到85%[2]。其病变以主要侵犯脊神经根、脊神经和颅神经，有时也累及脊膜、脊髓及脑部。病变严重可致死，死亡率达5%～10%[3]。

尽管多年来此病一直受到广泛关注，但至今对该病的治疗扔无特效药物。主要原因是空肠弯曲菌致GBS的致病机理尚不明确。目前一般认为空肠弯曲菌致GBS是因为空肠弯曲菌的LPS上的LOS在分子结构上与人类神经节苷脂表位之间具有分子模拟现象，从而导致交叉免疫反应。但是除了LOS外，是否还有其他大分子物质参与诱发GBS；在自身免疫过程中机体内还有哪些物质起到了正向协调作用或是治疗作用？如果能利用合适的动物模型找出这些关键因素，无疑对GBS的研究和治疗将起到极大的帮助。至今，国际上尚未有公认的空肠弯曲菌诱导GBS动物模型的报道。

在以往的研究中学者们已建立了多种动物模型。赵晓燕等用兔作为实验动物构建动物模型对O19型菌株对神经的致病作用进行研究[4]；C. Wim Ang等用小白鼠和兔作为模型，进行GBS的相关免疫反应研究[5]；Anthony P. Moran等用兔构建动物模型，研究CJ诱导GBS的分子致病机制[6]；G. Parthasarathy等用猪构建动物模型，研究CJ的侵染机制[7]。本研究拟采用广西巴马小香猪构建动物模型。

1 材料

1.1 菌株及实验动物

人源空肠弯曲菌LLcj由河北第二医科大学附属医院李春岩院士惠赠；1月龄广西巴马小香猪购自上海交通大学实验动物中心。

1.2 主要试剂

Carry-Blair运送培养基购自中国科学院上海昆虫科技开发公司；布氏肉汤、哥伦比亚血琼脂购自OXOID公司；微氧产气袋购自日本MGC公司；脱脂绵羊血购自南京助研生物技术有限公司；其它试剂均为国产分析纯级产品。

1.3 主要仪器

台式冷冻离心机、快速混匀器、核酸蛋白检测仪，德国Eppendoff公司；三气培养箱，德国Binder公司；恒温金属浴（CHB-100型），杭州大和热磁电子有限公司；酶标仪，美国 Thermo fi sher 公司；DMR显微镜、组织切片机，德国Lecia公司。

1.4 数据分析软件

SPSS 13.0数据分析软件。

2 方法

2.1 菌株复苏

将冻存菌株从-70 ℃冰箱中取出自然化冻。取200 μL菌液于5 mL布氏肉汤中，5%氧气、10%二氧化碳、85%氮气，37 ℃环境中培养48h。

2.2 传代培养

将复苏菌株接种于哥伦比亚血平板，5%氧气、10%二氧化碳、85%氮气，37℃环境中培养48h。连续传代2-3次，恢复菌株活性。

2.3 攻毒菌液的制备

挑取单菌落接种于布氏肉汤中（10% CO2，5% O2，85% N2，37 ℃）增菌48 h，4500 r/min离心5min后用生理盐水调制终浓度分别为3×1012cfu/ mL、3×1011cfu/mL、3×1010cfu/mL、3×109cfu/ mL的菌悬液备用。

2.4 实验动物分组

广西巴马小香猪20头，体重3.5-4.0kg，雌雄各半，随机分为5个组：对照组（4只）、高剂量攻毒组（4只）、中高剂量攻毒组（4只）、中剂量攻毒组（4只）及低剂量攻毒组（4只），采集各小猪血液，备用。动物试验得到江苏出入境检验检疫局伦理委员会的任可和授权。

2.5 攻毒方法

攻毒前禁食12h，攻毒时每头猪先灌注10 mL NaHCO3中和胃酸。高剂量组经口灌注3×1012cfu/mL的菌悬液10mL；中高剂量组经口灌注3×1011cfu/mL的菌悬液10 mL；中剂量组经口灌注3×1010cfu/mL的菌悬液10mL；低剂量组经口灌注3×109cfu/mL的菌悬液10mL；对照组口腔灌注生理盐水10mL。

2.6 样本采集

从第二周开始，每间隔一周各组选1头小猪用于样本采集。用BD Vacutainer血清采集管采集血液，血液采集完成后立即于4℃，4500 r/min离心30 min，吸取血清，置-70℃保存；采集大脑、小脑、腰膨大、颈膨大、坐骨神经、臂神经、动眼神经等组织样，经4%福尔马林固定，置液氮保存。24小时后，将4%福尔马林固定的组织适当清洗后重新存入新的4%的福尔马林溶液。

2.7 免疫学检测

ELISA检测血清中GM1-IgG抗体成分[10]。用PBS将GM1稀释至2 ug/mL，每孔100 μL，包被酶标板4℃过夜；1%牛血清白蛋白（BSA）封闭，37℃湿盒孵育2h；1：50稀释血清血清样本每孔100 μL，并设双复孔，37℃孵育2h；磷酸盐吐温缓冲液（PBST）洗3次，拍干；加入辣根过氧化物酶标记的IgG，37℃ 孵育1h；PBST洗3次；显色液（TMB）避光显色15 min；2M硫酸终止显色；450 nm波长读值。所得数据用SPSS 13.0数据分析软件比较分析。

2.8 组织病理切片

将大脑、小脑、腰膨大、颈膨大、臂神经、坐骨神经、动眼神经等组织固定后，用石蜡包裹、切片，做成约0.4um厚的病理切片。每个组织样本切6片，3片用于H/E染色，另外3片用于Luxol Fast Blue染色。切片用Leica DMR显微镜下观察并摄影。

3 结果

3.1 免疫学检测结果

棋盘法确定ELISA试验中最佳血清稀释度为1：50后，对20份血清样本分别检测，每份样做3个平行重复。将对照组的4个检测结果取平均值后分别同16个病理组进行比较，以比值大于2.0者为检测阳性。攻毒前20份血清均为GM1-IgG抗体检测阴性；攻毒后，在16个病理组中有12份的血清中GM1-IgG抗体为检测阳性，阳性检出率为81.25%。4个对照样血清均为检测阴性，其他GM1-IgG抗体检测阴性分别出现在高剂量组（1个）、中剂量组（2个）和低剂量组（1个）。在设计的梯度病理组中并没有显著的梯度差异（表1）。

表1 血清中GM1-IgG 抗体含量检测结果

3.2 组织病理切片

分别对20头猪的相应组织做病理切片，每个组织做6张切片，3张用于H/E染色，3张用于LFB染色。根据病理切片观察只有8头猪经H/E染色后能观察到炎症反应现象，其中低剂量组2个（分别采样与第四周和第五周），中剂量组1个（采样于第四周），中高剂量组3个（分别采样于第四周和第五周），高剂量组2个（采样于第五周）；且这8头猪中只有2头只有两个经LFB染色后能观察到轻微脱髓鞘现象，其中中高剂量组1个（采样于五周），高剂量组1个（采样于第四周）。

3.2.1 H/E染色 切片H/E染色结果显示，在发病模型动物的大脑出现了噬神经元、小血管周围间隙增宽、神经中央染色溶解等现象（图1）。

3.2.2 Luxol Fast Blue 染色 切片LFB染色结果显示，在发病模型动物的小脑白质和腰膨大出现了轻度脱髓鞘现象，（图2）。

图1 大脑H/E染色病理切片图

图2 LFB染色病理切片图

4 讨论

空肠弯曲菌是引起全世界人类细菌性腹泻的主要病原菌，对人的感染率不亚于沙门氏菌和志贺氏菌，特别是其作为前驱因子诱发GBS，对人类造成了极大的威胁。目前，空肠弯曲菌已引起人们广泛关注。在研究空肠弯曲菌致病机理的过程中，研究人员构建了多种动物模型，然而至今，国际上尚未有公认的空肠弯曲菌诱导GBS动物模型的报道。

因此，我们决定模拟人感染GBS的模式，建立一个适用于研究空肠弯曲菌诱发GBS致病机理的动物模型。在模型动物选择，鉴于猪在心血管系统、消化系统、皮肤系统、骨骼发育、营养代谢等方面与人类具有较大的相似性，利用猪构建动物模型，可以极大程度上模拟人感染CJ、引发肠胃炎、GBS病发的整个过程；其次，巴马小型猪在原产地均为长期近亲交配形成的封闭群体，具有体型小、遗传稳定等特点，这样既方便实验操作，又保证可个体间在基因型方面的均一性，还便于后期基因表达的研究[8，9]。故用巴马小型猪构建动物模型可以保证此项研究的可操作性和科学性。在菌株选择中，为保证菌株的致病能力以及与人的极大相关性，我们选择了从GBS患者体内分离得到的致人GBS源空肠弯曲菌。

在动物模型的构建中，我们设立了4个梯度攻毒组和1个阴性对照组，期望了解不同攻毒剂量所达到的不同的免疫效果。根据免疫学检测结果显示，高剂量组在整体上略高于低剂量组，但是梯度攻毒组之间并没有表现出显著的梯度差异，而且有些高剂量组的免疫学反应还明显低于低剂量组。一方面，表明上述攻毒剂量均已达到或超过最适攻毒剂量；另一方面，也说明空肠弯曲菌作为前驱感染因子的不确定性，并非有空肠弯曲菌感染就会诱发免疫反应或者并非高剂量的空肠弯曲菌就能引发高强度的免疫反应，然而这可能与个体体质差异有关。

综合分析免疫学检测结果，通过ELISA检测血清中的GM1-IgG抗体，16份试验组血清中只有12份血清检测为GM1-IgG抗体阳性，阳性率达81.25%。这再次证明了CJ诱发GBS的不确定性，由于个体差异和其他方面因素，并非所有的模式动物感染CJ后都出现GBS症状；同时这也说明我们构建动物模型成功，大部分模型动物都产生了自身免疫反应，在其血清中都含有较高含量的GM1-IgG抗体，符合CJ感染相关轴索型GBS的分子模拟理论[10]。

先前研究表明，GBS症状会伴随着神经组织的炎症反应或者典型的脱髓鞘现象[11]，因此我们通过H/E染色和LFB染色来分析模型动物的病变情况。通过H/E染色，我们在12个免疫反应阳性个体中发现有8个的相关组织出现了大脑噬神经元、大脑小血管周围间隙增宽、神经元中央染色质出现程度不等的溶解等病变现象；通过LFB染色，我们发现其中有2个免疫反应阳性个体的小脑和腰膨大区域出现了典型的GBS病变症状即脱髓鞘。在12个免疫反应阳性个体中，只有8个个体表现出了相应的病变反应且只有2个个体表现出了典型的GBS症状，这可能是由于空肠弯曲菌的感染只诱发的相应的免疫反应而没有对相应的组织造成实质性的伤害，也有可能是因为大部分个体的自身免疫反应对相关组织造成的损伤过于微妙，已至通过病理切片无法辨别。虽然只有2个个体出现了脱髓鞘现象，但这足以表明此动物模型构建成功以及对空肠弯曲菌致GBS致病机理研究的实用性。

免疫学检查表明，上述攻毒剂量均能达到病变要求，而病理切片结果则显示在攻毒后第四周和第五周采集样本的个体病变现象较为明显，因此确定此动物模型的攻毒剂量在3×109cfu/mL～3×1012cfu/mL均可，组织样本及血液的采集的最佳时机为攻毒后4～5周。

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[4] 赵晓燕，薛平，刘瑞春，等. 空肠弯曲菌抗体对兔周围神经致病作用的研究[J].中风与神经疾病杂志，1999，6（16）：325-327.

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[6] Moran AP，et al. Antibodies induced by ganglioside-mimicking Campylobacter jejuni lipooligosaccharides recognise epitopes at the nodes of Ranvier [J]. Journal of Neuroimmunology，2005，165（1/2）：179-185.

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Establishment of the Animal Model for C. jejuni Induced GBS

Xue Feng1，Zeng Dexin1，Xu Fei1，Yang Yuefei2， Wang Xiaobo2，Zhang Xiaorong2，Li Zhengzhong3，Jiang Yuan1
（1.Animal and Plant and Food Inspection Center，Jiangsu Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau，Nanjing，Jiangsu 210001；2.College of Veterinary Medicine，Yangzhou University，Yangzhou，Jiangsu 225009；3 Department of Neurology，The Second Hospital Affiliated to Hebei Medical University，Shijiazhuang，Hebei 050000）

[Objective] Bama mini-pig was used to establish the animal model for C. jejuni induced GBS. [Methods] C. jejuni isolate inducing GBS in human was selected to infect pigs. Four groups，each with four pigs，were orally infused respectively with four concentration bacterial suspension of 3×1012cfu/mL，3×1011cfu/mL，3×1010cfu/mL and 3×109cfu/mL. A control group was set up and orally infused with normal saline. From the second week，blood and tissue samples were collected regularly to determine the immune reaction and lesions by ELISA and biopsy. [Results] 12 of 16 samples in the infected groups were positive for GM1-IgG antibodies with a positive rate of 81.25%. However，there was no signifi cant difference between the groups infected with different concentration gradients. The H/E staining revealed neuronophagia，enlarged Virchow-Robin spaces，central chromatolysis and so on in the cerebrum of the infected animals；LFB staining showed mildly demyeliantion in the cerebellar white matter and the lumbar enlargement of the infected animals. [Conclusion]The result showed that the C. jejuni concentration for inducing GBS in minipigs was 3×109cfu/mL～3×1012cfu/mL and the best time to collect blood and tissue samples was 4～5 weeks after inoculation.

Campylobacter jejuni；GBS；Bama mini-pig；animal model

R-332；R378.3

：A

：1005-944X（2015）02-0019-05

国家质检总局科研项目（2013IK164）；江苏省333工程培养基金资助项目（BRA2012205）；国家863项目（2012AA101001）

蒋原

注：前三位作者同等贡献