白芍总苷对EAE大鼠外周免疫器官及中枢神经系统NF-κB p65表达的影响

李世举，王艳旭，吴松鹰，吴成翰，王谨敏(福建中医药大学附属第二人民医院脑病科，福州 350003;福建中医药大学附属人民医院脑病科;通讯作者，E-mail:4767086@qq．com)

多发性硬化(multiple sclerosis，MS)是神经内科常见的一种自身免疫性疾病，病残率高。实验性自身免疫性脑脊髓炎(experimental autoimmune encephalomyelitis，EAE)是国际公认的 MS的动物模型，可以用于评价药物对MS的治疗作用，并探索其治疗机制。NF-κB作为重要的核转录因子，是炎症反应的总开关之一，与免疫细胞的增殖、活化和凋亡密切相关，在MS及EAE发病及病情发展中起关键作用［1］。白芍总苷(total glucosides of paeony，TGP)为白芍中提取的有效成分，具有多途径抑制自身免疫反应的药理作用［2］。国内目前已开展TGP治疗EAE 的研究［3，4］，并取得良好疗效，但目前尚未见TGP对EAE外周免疫器官及中枢神经系统NF-κB p65影响的研究。本研究采用TGP预防性治疗EAE大鼠，观察TGP对EAE大鼠外周免疫器官及中枢神经系统NF-κB p65表达的影响。

1 材料与方法

1．1 实验动物

6-8周健康清洁雄性Lewis大鼠60只，体质量150-180 g，动物由上海斯莱克实验动物有限公司提供，动物许可证号:SCXK(沪)2012-0002。雌性豚鼠13只，体质量450 g到500 g，由上海市松江区松联实验动物场提供，动物许可证号:SCXK(沪)2012-0011。

1．2 白芍总苷及主要试剂

白芍总苷胶囊，三九医药股份有限公司生产(批号:110904，以白芍总苷计 0．3 g/粒);NF-κB p65一抗(美国Santa Cruz公司);二步法免疫组化试剂盒(北京中杉金桥生物技术有限公司);DAB显色系统试剂盒、BCIP/NBT显色液、核快红复染液(福州迈新生物技术开发公司);苏木精、伊红染色剂(北京经科化学试剂经营公司);弗氏完全佐剂(美国Sigma公司，含灭活结核杆菌1 mg/ml);百日咳疫苗(Bordetella Pertussis Vaccine，BPV)由上海生物制品研究所提供;灭活牛型结核杆菌由上海生物制品研究所提供(1 ml约含100 mg)。

1．3 大鼠分组及EAE模型的建立

大鼠采用随机数字法分为对照组(n=10)、模型组(n=25)、TGP组(n=25)。无菌条件下取豚鼠脊髓匀浆，先将与该匀浆液等体积的弗氏完全佐剂与灭活结核杆菌混合，使其成为含6 mg/ml的弗氏完全佐剂。在冰浴条件下使两者充分研磨形成诱导乳剂。TGP组及模型组大鼠后肢足掌皮内注射诱导乳剂，共0．4 ml/只。每只大鼠背部皮下注射0．1 ml BPV。对照组以等量PBS代替豚鼠脊髓匀浆，余同其他组。

1．4 药物干预

按照药理学实验动物剂量换算公式，根据人类TGP的常用剂量来换算大鼠的剂量，采取0．2 g/(kg·d)的剂量。白芍总苷药片溶于于生理盐水溶液中制成悬浊液。TGP组的大鼠，从免疫第1天起(免疫当天记为第1天)，每天经口灌服白芍总苷悬浊液0．2 g/kg。对照组及模型组给予同体积生理盐水。

1．5 临床观察

常规饲养三组大鼠，自免疫后第1天起，由同一人同一时间段单盲观察发病情况，行临床神经功能评分。临床神经功能评分采用5分法［5］:0分，无任何体征;1分，尾部无力;2分，后肢无力;3分，双后肢完全瘫痪;4分，前后肢瘫痪;5分，濒死状态或死亡。以大鼠达到或超过1分为临床EAE发病。大鼠每日的平均临床神经功能评分，分别由当日临床积分总和除以该组大鼠的数目获得。

1．6 组织切片的制备

大鼠在免疫后第14天，麻醉后经升主动脉灌注生理盐水250 ml，继以含4%多聚甲醛0．1 mol/L PBS液300 ml灌注后，取脑、脊髓、脾及淋巴结置于10%的甲醛中固定18 h。石蜡包埋，制4 μm厚切片。

1．7 病理学检查

常规HE染色，每只动物中枢神经各取4张切片(大脑视交叉水平、脑干、颈膨大、腰膨大各随机取1张切片)，光学显微镜下观察，计算炎症浸润细胞数目，把各节段炎症浸润细胞数相加作为该只大鼠的总的炎症浸润细胞数。

1．8 免疫组化检测NF-κB p65

采用二步法，DAB显色，苏木素复染，NF-κB p65(1∶100)，以0．01 mol/L PBS 代替一抗作阴性对照。具体步骤:石蜡切片常规脱蜡、水化，ddH2O冲洗，抗原微波修复，PBS冲洗，滴加3%过氧化氢室温孵育15 min，PBS冲洗，滴加一抗4℃孵育过夜，PBS冲洗，滴加二抗，室温孵育15 min，PBS冲洗，DAB显色，ddH2O及流水冲洗，苏木素复染，ddH2O冲洗，0．5%盐酸酒精分化，流水冲洗，梯度酒精脱水，二甲苯中透明，封片。每只动物中枢神经系统各取4张切片(大脑视交叉水平、脑干、颈膨大、腰膨大各随机取1张切片)，脾及淋巴结随机各取3张切片，光学显微镜下观察，每张切片随机取5个不重叠的高倍视野(×400)。胞质及(或)胞核出现浅黄色-黄褐色者为NF-κB p65阳性细胞。

用数字显微摄影系统拍照，用Image-Pro Plus 5．0图像分析软件，测定每个高倍视野下阳性细胞的积分光密度(integral optical desity，IOD)值。取均数作为该只大鼠的中枢神经系统、脾及淋巴结的NF-κB p65的IOD值。

1．9 统计学分析

采用SPSS 20．0软件处理。发病率用Fisher确切概率法检验。计量资料以±s表示，两组间比较采用t检验，多组间比较采用单因素方差分析，进一步两两比较采用SNK-q法。以P＜0．05为差异有统计学意义(发病率两两比较检验水准经Bonferroni校正，以P＜0．012 5为差异有统计学意义)。

2 结果

2．1 动物临床表现

对照组大鼠不发病，模型组发病率为100%，TGP组发病率96%。模型组和TGP组大鼠于免疫后8 d开始发病，逐渐出现尾巴、后肢和前肢无力乃至瘫痪，食欲下降，毛发失去光泽，重者伴大小便失禁，免疫后第12天平均神经功能评分达到高峰。发病率三组间比较差异有统计学意义(P＜0．05)。进一步两两比较，模型组发病率与TGP组比较差异无统计学意义(P＞0．012 5)，模型组发病率与对照组比较差异有统计学意义(P＜0．012 5)，TGP组发病率与对照组比较差异有统计学意义(P＜0．012 5)。TGP组发病潜伏期比模型组长，差异有统计学意义(P＜0．05)。TGP组临床神经功能评分最高值比模型组明显降低，差异有统计学意义(P＜0．05，见表1)。

2．2 动物病理学改变

发病的大鼠脑及脊髓可见多发炎性细胞浸润，从形态上看，炎性细胞多为淋巴细胞、巨噬细胞。部分小血管管周有大量炎性细胞浸润，形成“袖套”状改变，还可以见到淋巴细胞结节形成。病灶多位于白质，灰质也出现少量上述病变，但程度较轻。TGP组炎症浸润细胞比模型组少，两组比较差异有统计学意义(P＜0．05)。对照组大鼠脑及脊髓病理检查未见异常(见表1、图1)。

表1 大鼠临床评估及病理改变Table 1 Clinical assessment and pathological changes in rats

图1 三组大鼠脊髓病理改变(HE染色，×400)Figure 1 The pathological changes of spinal cord in three groups(HE，×400)

2．3 NF-κB p65 的表达

对照组脑及脊髓有极少量NF-κB p65蛋白阳性细胞，散在分布，从形态上判断，为神经胶质细胞、神经元、内皮细胞。模型组可见脑及脊髓大量的NF-κB p65蛋白阳性细胞，散在分布，以白质区居多，从形态上判断，神经胶质细胞、神经元、内皮细胞及炎症浸润细胞均有NF-κB p65的表达，但以炎症浸润细胞特别是血管周围炎症浸润细胞高表达NF-κB p65为主，部分NF-κB p65蛋白核转移，提示 NF-κB的活化，与对照组相比，差异有统计学意义(P＜0．05)。TGP组脑及脊髓NF-κB p65蛋白的表达较对照组高，但较模型组低，差异有统计学意义(P＜0．05)。三组大鼠淋巴结及脾均有NF-κB p65蛋白阳性细胞。模型组脾及淋巴结NF-κB p65蛋白的表达高于对照组及TGP组，差异有统计学意义(P＜0．05)。TGP组脾及淋巴结NF-κB p65蛋白的表达高于对照组，差异有统计学意义(P＜0．05，见表2，图2-4)。

表2 大鼠外周免疫器官及中枢神经系统NF-κB p65蛋白的IODTable 2 The IOD of NF-κB p65 protein in the peripheral immune organs and CNS in rats

图2 三组大鼠脊髓NF-κB p65的表达(DAB显色，苏木素复染，×400)Figure 2 The protein expression of NF-κB p65 in spinal cord in three groups(DAB coloration，hematoxylin re-staining，×400)

图3 三组大鼠脾NF-κB p65的表达(DAB显色，苏木素复染，×400)Figure 3 The protein expression of NF-κB p65 protein in spleen in three groups(DAB coloration，hematoxylin re-staining，×400)

3 讨论

MS的发病机制包括外周自身反应性淋巴细胞(主要是T细胞)的活化增殖，血脑屏障的破坏，自身反应性淋巴细胞进入中枢神经系统，启动炎症反应并进一步破坏血脑屏障，进一步募集抗原特异的淋巴细胞进入中枢神经系统，促使其他炎症细胞和效应分子如巨噬细胞浸润到中枢神经系统［6，7］。脾及淋巴结是主要的外周免疫器官，外周免疫器官在自身免疫性疾病的发生发展过程中起着重要的作用［7，8］。目前认为抗原特异的淋巴细胞激活后在外周免疫器官不断增殖，然后不断释放入血液及淋巴循环中，是MS患者中枢神经系统活化的淋巴细胞的主要来源［7，8］。

NF-κB是最为重要的核转录因子之一，广泛参与了多种基因的表达调控，其中包括多种与免疫反应密切相关的细胞因子和黏附分子，是免疫反应的总开关之一。NF-κB引起的信号级联反应在MS和EAE发病及病情进展中起着关键作用。NF-κB能促进T细胞向Th1细胞及Th17细胞分化，上调TNF-α、IL-1、IL-2、IFN-γ、GM-CSF 等炎性因子及 VCAM-1、ICAM-1等细胞黏附分子的表达，加重EAE临床症状［1］。NF-κB的表达及活化对外周及中枢神经系统自身反应性淋巴细胞的活化与增殖是必须的，选择性NF-κB 抑制剂能减轻 EAE 病情［1］。NF-κB p65 亚基是NF-κB最重要的具有转录活性的亚基。

TGP在目前的临床用药剂量下具有多途径抑制自身免疫反应的药理作用，对多种自身免疫性疾病的治疗取得良好效果［2］。研究表明 TGP能抑制NF-κB 蛋白的表达与活化［2，9］，这对 EAE 或 MS 的治疗具有重要意义。徐晓娅等［4］的研究表明，TGP能降低EAE大鼠血清IFN-γ、TNF-α的水平，这可能是通过抑制NF-κB来实现的。

在本实验中，TGP组与模型组比较，TGP组的发病潜伏期延长(P＜0．05)，神经功能评分降低(P＜0．05)，中枢神经系统炎症浸润细胞减少(P＜0．05)，临床与病理均表明该药对EAE的确有治疗作用。通过本实验，我们发现模型组大鼠的淋巴结及脾NF-κB p65的表达比对照组高(P ＜0．05)，说明EAE大鼠淋巴结及脾NF-κB p65的表达上调。NF-κB表达上调能促进T细胞向Th1细胞及Th17细胞分化，促进淋巴结及脾自身反应性淋巴细胞的进一步活化与增殖［1］，进而进入中枢神经系统的自身反应性淋巴细胞增多，加重EAE的病情。TGP组淋巴结及脾 NF-κB p65的表达较模型组低(P＜0．05)，表明TGP能抑制 EAE大鼠的淋巴结及脾NF-κB p65的表达，从而减轻自身反应性淋巴细胞的进一步活化与增殖，有利于减轻EAE的病情。TGP组淋巴结及脾NF-κB p65的表达较对照组高(P＜0．05)，说明TGP尚不能完全抑制淋巴结及脾NF-κB p65的表达，仅能部分抑制淋巴结及脾NF-κB p65的表达。对照组脑与脊髓NF-κB p65的表达极少，模型组脑与脊髓高表达NF-κB p65，主要位于血管周围的炎症浸润细胞，部分NF-κB p65蛋白核转移，提示NF-κB处于激活状态，这与国内外的实验结果［1，10］一致。目前的研究［1］表明中枢神经系统 NF-κB的表达及活化能使EAE的病情加重。在本实验中，TGP组脑与脊髓 NF-κB p65的表达比模型组低(P＜0．05)，说明TGP能抑制EAE大鼠中枢神经系统NF-κB p65的表达，从而减轻EAE的病情。综上，我们推测TGP治疗EAE的部分机制可能是通过抑制外周免疫器官NF-κB表达，从而减少外周免疫器官内自身反应性淋巴细胞的活化增殖，减少进入淋巴系统及血循环中自身反应性淋巴细胞的数量，进而减少自身反应性淋巴细胞进入中枢神经系统的数量，减轻EAE大鼠中枢神经系统炎症细胞的浸润;在中枢神经系统，TGP可抑制NF-κB的表达，从而抑制已活化的炎症浸润淋巴细胞的进一步增殖及淋巴细胞在中枢神经系统的进一步募集，减轻EAE大鼠中枢神经系统炎症细胞的浸润程度，并在转录水平减少炎性细胞因子及黏附分子的分泌，抑制了NF-κB介导的炎症反应，切断了其后的一系列炎症脱髓鞘过程，进而减轻了EAE的病情。

总之，TGP对EAE的治疗是有效的，其机制之一可能是通过抑制外周免疫器官及中枢神经系统NF-κB p65的表达，从而抑制外周免疫器官及中枢神经系统自身反应性淋巴细胞的活化、增殖，抑制了NF-κB介导的炎症反应，减轻EAE的病情。当然，TGP治疗MS还只处于动物实验研究阶段，其治疗机制有待进一步研究。TGP作为一种成熟的中成药，其副作用少，价格不高，相信随着研究的深入，在MS的治疗中应该有较大的作为。

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