Notch基因胞内活化部分真核表达载体p3XFLAG-CMV7-NICD1的构建与鉴定

（1.中国医科大学附属盛京医院眼科，沈阳 110004；2.沈阳市第四人民医院眼科，沈阳 110031）

Notch基因胞内活化部分真核表达载体p3XFLAG-CMV7-NICD1的构建与鉴定

刘蕾1，2，肖伟1

（1.中国医科大学附属盛京医院眼科，沈阳 110004；2.沈阳市第四人民医院眼科，沈阳 110031）

目的构建Notch1基因胞内活化部分真核表达载体p3XFLAG-CMV7-NICD1，为进一步研究和解析Notch1基因在促进人晶状体上皮细胞间质化过程的作用做准备。方法从SRA01/04细胞中提取总RNA，RT-PCR法反转录合成cDNA。特异扩增目的基因片段NICD1，与p3XFLAG-CMV7载体连接后转化大肠杆菌DH5α，LB平板培养基筛选菌落，抽提质粒。并用酶切，测序，转染细胞后检测蛋白表达等方法验证。结果获得重组的p3XFLAG-CMV7-NICD1真核表达载体质粒，经双酶切及测序检测，NICD1基因插入载体部位正确，碱基序列正确。Western blot结果显示，在转染p3XFLAG-CMV7-NICD1的细胞中有NICD1蛋白的表达。结论p3XFLAG-CMV7-NICD1真核表达载体质粒构建成功，为进一步研究Notch1传导通路与白内障摘除术后发生后囊膜混浊的关系奠定基础。

Notch1信号通路；NICD1；上皮间质转化；后囊膜混浊

晶体后囊膜混浊（posterior capsular opacification，PCO）是白内障摘除术后最常见的并发症，常常导致术后视力下降。前囊膜上残留的细胞迁移到后囊膜并进行上皮细胞上皮间质转化（epithelialmesenchymal transition，EMT）是后囊膜混浊发生的关键。有研究表明Notch信号传导通路且能够促进上皮间质纤维化。当Notch1配体与相邻细胞的受体结合后即触发Notch1信号活化，NICD1即为Notch1蛋白的活化形式［1］。本课题从SRA01/04细胞中提取总RNA，经RT-PCR扩增获得Notch1基因胞内段基因片段（NICD1）构建真核表达质粒p3XFLAG-CMV-7-NICD1，为进一步研究Notch1传导通路与白内障摘除术后发生后囊膜混浊的关系奠定基础。

1 材料与方法

1.1 质粒与细胞

真核表达载体p3XFLAG-CMV-7（购自Sigma公司），SRA01/04细胞（中国医科大学实验室保存）及感受态细胞E.coli Competent cells DH5α（购自Takara公司）。

1.2 试剂

RNAprep pure培养细胞/细菌总RNA提取试剂盒、TIANScript cDNA第一链合成试剂盒，普通DNA产物纯化试剂盒（购自TIANGEN公司）。Taq DNA Polymerase，dNTPs脱氧核苷酸（购自Takara公司）。质粒DNA提取试剂盒和DNA胶回收试剂盒（购自AXYGEN公司）。DNA T4连接酶、XbaI/BamHI核酸内切酶（购自NEB公司）。LipofectamineTMLTX转染试剂（购自Invitrogen公司）。兔抗NICD1多克隆抗体（购自Cell Signaling Technology公司），兔抗Flag多克隆抗体（购自北京博奥森公司）。

1.3 引物设计与合成

参照文献［2］，并从GenBank获取Notch1胞内段基因已知序列，根据末端氨基酸序列分析结果，用Primer 5软件设计出可扩增NICD1相对应碱基在内的引物，并分别在上游及下游引物引入XbaI/Bam-HI酶切位点，上游引物：5C-GCCTCTAGAGTGCTGC TGTCCCGCAAGCGC-3C，下游引物：5C-CGGGATC CTTATTTAAATGCCTCTGGAATGTGGG-3C，引物由TaKaRa公司合成。

1.4 胞内段NICD1目的基因扩增

按TaKaRa公司试剂盒说明书提取SRA01/04细胞总RNA，逆转录合成cDNA。以此cDNA为模板，运用以上设计引物，按照程序行PCR扩增：93℃预变性3 min；93℃变性30 s，57℃退火30 s，72℃延伸1 min，循环35次；72℃延伸10 min。

1.5 p3XFLAG-CMV-7-NICD1重组质粒的构建

XbaI/BamHI同时对目的DNA片段及质粒p3XFLAG-CMV-7进行双酶切（3 h），琼脂糖凝胶电泳回收目的DNA酶切片段和p3XFLAG-CMV-7载体酶切片段并定量，建立如下连接反应体系：p3XFLAG-CMV-7载体1 μL，NICD1插入片段1 μL，T4 DNA连接酶0.5 μL，10×连接缓冲液0.5 μL，加重去离子水2 μL，总反应体积5 μL。22℃连接1 h。结束后转化感受态大肠埃希菌DH5α，涂布于37℃预热的含氨苄青霉素的LB平板，37℃倒置培养过夜。随机挑取转化子接种于LB液体培养基，37℃、220 r/min振摇培养过夜。按AXYGEN质粒DNA提取试剂盒说明书提取质粒DNA。

1.6 p3XFLAG-CMV-7-NICD1重组质粒的鉴定

p3XFLAG-CMV-7-NICD1重组质粒的XbaI/ BamHI双酶切反应体系：XbaI，1 μL；BamHI，1 μL； 10xNEB Buffer，3 μL，p3XFLAG-CMV-7-NICD1，5 μL；100×BSA，0.3 μL；ddH2O，20.7 μL。37℃3 h。质粒测序由Takara公司完成。

1.7 细胞转染及Western blot检测

按照LipofectamineTMLTX说明书进行转染。实验组p3XFLAG-CMV-7-NICD1，空载体p3XFLAGCMV-7为对照组分别用LipofectamineTMLTX试剂转染入SRA01/04细胞中。转染4 h后换液，24 h后进行Western blot检测。采用RIPA蛋白提取液制备细胞总蛋白，BCA法蛋白质定量后取40 μg总蛋白进行Immunoblotting检测带Flag标签的NICD1的表达。以兔抗Flag多克隆抗体（1∶1 000）为一抗，辣根酶标记的山羊抗兔IgG（1∶3 000）为二抗，抗体反应结束后加入Pierce公司的增强型ECL化学发光试剂盒显色。

2 结果

2.1 NICD1基因片段和真核表达载体p3XFLAGCMV-7的制备

真核表达载体p3XFLAG-CMV-7和RT-PCR扩增后的NICD1基因片段，经1%琼脂糖凝胶电泳结果（图1），分别可见约4 700 bp和2 361 bp的特异条带，条带分子大小与预计相同。

图1 p3XFLAG-CMV-7和NICD1片段电泳结果Fig.1 RT-PCR products of p3XFLAG-CMV-7 and NICD1

2.2 酶切鉴定重组表达质粒p3XFLAG-CMV-7-NICD1

重组质粒用XbaI/BamHI双酶切后琼脂糖凝胶电泳（图2），可见切下大小约为4 700 bp及2 300 bp的2条条带，分别为p3XFLAG-CMV-7和NICD1。片段大小与预测结果一致。表明NICD1基因已成功克隆至真核表达载体p3XFLAG-CMV-7中。

2.3 重组表达质粒p3XFLAG-CMV-7-NICD1测序分析

图2 p3XFLAG-CMV-7-NICD1双酶切结果Fig.2 Digestion products of p3XFLAG-CMV-7-NICD1 with enzymes

重组质粒p3XFLAG-CMV-7-NICD1送Takara公司进行测序鉴定（图3），目的片段与GenBank中人Notch1胞内段基因的序列进行比对，测序结果与GenBank报道的人Notch1胞内段基因序列一致。鉴定结果表明目的片段已正确插入p3XFLAG-CMV-7表达载体。

2.4 真核表达载体p3XFLAG-CMV-7-NICD1在SRA01/04细胞中的表达

通过LipofectamineTMLTX试剂将p3XFLAGCMV-7-NICD1和对照的空载体分别转染SRA01/04细胞，24 h后提取总蛋白，进行Western blot检测。结果如图4显示，在实验组中有Flag-NICD1蛋白的表达，分子量大小约120 kDa，而转染空质粒的细胞未见表达。

图3 p3XFLAG-CMV-7-NICD1真核表达载体测序结果Fig.3 The gene sequencing results of p3XFLAG-CMV-7-NICD1

图4 重组蛋白FLAG-NICD1的Western blot检测结果Fig.4 Expression of FLAG-NICD1 protein analyzed by Western blot

3 讨论

后发性白内障指白内障摘出术（囊外摘出、单纯吸除或超声乳化白内障吸除）后，或外伤性白内障部分皮质吸收后残留晶状体上皮细胞（lens epkhelial cells，LECs）增生、分化并移行导致的晶状体后囊膜混浊，简称后发障。PCO是白内障术后最常见的影响视力的并发症［3］。成人白内障术后2年内有20%～30%的患者因PCO而视力下降［4］，ECCE术后5年内仍有43%的患者会发生PCO［5］。而儿童术后早期即会发生严重的后发障，且发生率高达100%。

目前研究认为，晶状体上皮细胞增殖、迀移、上皮间充质转化、胶原沉积和晶状体纤维组织形成是PCO的主要原因。白内障手术刺激可能诱导晶状体发生创伤愈合反应，残余的LECs增殖并沿后囊膜迁移，经过上皮间充质转化形成晶状体纤维组织［6］。与其他组织器官的纤维化机制有所不同，肾间质纤维化和肺纤维化组织中的肌成纤维细胞可由成纤维细胞和上皮细胞转化形成，而晶状体组织局部不存在成纤维细胞，晶状体纤维化过程中肌成纤维细胞只来源于上皮细胞，因此，研究EMT在PCO发生过程中的作用有重要价值［7，8］。诱导EMT的主要分子信号通路有Wnt/p-catenin信号通路、细胞外基质/ ILK信号通路和TGFp/Smad信号通路以及Notch信号通路。1917年，Morgan及其同事在果蝇体内发现一种基因，因其功能部分缺失可导致果蝇翅缘出现缺口，故命名该基因为Notch［9］。

近来有研究表明Notch1在晶状体上皮细胞中有表达，而且在正常晶状体组织及再生晶状体组织中均检测到Notch1表达［10，11］。Notch1信号激活后，NICD1是Notch1的活化形式，NICD1进入细胞核内发挥传递信号的作用。外源性NICD1编码基因导入靶细胞后，其对靶基因的调控与Notch1配体所诱导的Notch1信号途径激活一致［12，13］。

本研究通过从SRA01/04细胞中提取总RNA，RT-PCR法反转录合成cDNA。进一步扩增获Notch1胞内段基因片段（NICD1），将其克隆于真核表达载体p3XFLAG-CMV-7，构建真核表达质粒p3XFLAG-CMV-7-NICD1，酶切鉴定结果与预期一致；测序结果与GenBank报道的人Notch1胞内段基因序列完全一致。Western blot检测p3XFLAG-CMV -7-NICD1转染细胞中有NICD1蛋白表达。为进一步研究Notch1信号上调促进EMT和白内障摘除术后发生后囊膜混浊的关系奠定基础。

［1］De Strooper B，Annaert W，Cupers P，et al.A presenilin-1-dependent gamma-secretase-like protease mediates release of Notch intracellular domain［J］.Nature，1999，398（6727）：518-522.

［2］Ong CT，Cheng HT，Chang LW，et al.Target selectivity of vertebrate notch proteins.Collaboration between discrete domains and CSL-binding site architecture determines activation probability［J］.J Biol Chem，2006，281（8）：5106-5019

［3］Awasthi N，Guo S，Wagner BJ.Posterior capsular opacification：a problem reduced but not yet eradicated［J］.Arch Ophthalmol，2009，127（4）：555-562

［4］Ibarak N.A brighter future for cataract surgery［J］.Nat Med，1997，3（9）：958-960.

［5］Sundelin K，Sjostrand J.Posterior capsule opacification 5 years after extracapsular cataract extraction［J］.J Cataract Refract Surg，1999，25（2）：246-250.

［6］Wormstone IM.Posterior capsule opacification：a cell biological perspective［J］.Exp Eye Res，2002，74（3）：337-347.

［7］Saika S，Yamanaka O，Flanders KC，et al.Epithelial-mesenchymal transition as a therapeutic target for prevention of ocular tissue fibrosis［J］.Endocr Metab Immune Disord Drug Targets，2008，8（1）：69-76.

［8］Saika S.Relationship between posterior capsule opacification and intraocular lens biocompatibility［J］.Prog Retin Eye Res，2004，23（3）：283-305.

［9］S jolund J，Manetopoulos C，Stockhausen MT，et al.The Notch pathway in cancer：Differentiation gone awry［J］.Eur J Cancer，2005，41（17）：2620-2629.

［10］Chen X，Ye S，Xiao W，et al.ERK1/2 pathway mediates epithelialmesenchymal transition by crossinteracting with TGFβ/Smad and Jagged/Notch signaling pathways in lens epithelial cells［J］.Int J Mol Med，2014，33（6）：1664-1670.

［11］Saravanamuthu SS，Gao CY，Zelenka PS.Notch signaling is required for lateral induction of Jagged1 during FGF-induced lens fiber differentiation［J］.Dev Biol，2009，332（1）：166-176.

［12］Miele L.Notch signaling［J］.Clin Cancer Res，2006，12（4）：1074-1079.

［13］Talora C，Cialfi S，Segatto O，et al.Constitutively active Notch1 induces growth arrest of HPV-positive cervical cancer cells via separate signaling pathways［J］.Exp Cell Res，2005，305（2）：343-354.

（编辑裘孝琦）

Construction and Identification of Recombinant Plasmid ofp3XFLAG-CMV7-NICD1

LIULei1，2，XIAOWei1
（1.DepartmentofOphthalmology，Shengjing Hospital，China MedicalUniversity，Shenyang 110004，China）

ObjectiveTo constructthe eukaryotic expression vectorof Notch1intracellulardomain，p3XFLAG-CMV7-NICD1，so as to prepare for the further research and exploration of effect of Notch1on promoting epithelial-mesenchymal transition of human lens epithelial cells.MethodsThe cDNA fragmentwas reversely transcribed by RT-PCRfrom totalRNA extracted from the SRA01/04 cells and was encoded with the specific amplification-targeted NICD1was obtained from the SRA01/04 cells，then the cDNA fragment was inserted into p3XFLAG-CMV7 to transcribe Escherichia coli DH5α.And the recombinant plasmid was extracted after bacterial screening by LB plating medium and confirmed by the restriction endonuclease digestion and DNA sequencing.ResultsThe target gene obtained had the same molecular size as predicted.It was indicated that recombined p3XFLAG-CMV7 plasmid contained correct recombinant human Notch1sequences and p3XFLAG-CMV7-NICD1was constructed successfully.The western blotting showed protein NICD1 expressed in SRA01/04 cells transfected with p3XFLAG-CMV7-NICD1.ConclusionThe successful construction of p3XFLAG-CMV7-NICD1will provide a foundation for a further study studies in on the effect relationship of Notch signaling pathway and in posteriorcapsularopacification（PCO）aftercataractextraction.

Notch1 signaling pathway；NICD1；epithlial-mesenchymal transition；posterior capsular opacification

R776.1

A

0258-4646（2015）03-0217-04

刘蕾（1979-），女，主治医师，博士研究生.

肖伟，E-mail：xiaow@sj-hospital.org

2014-10-30

网络出版时间：