一株协助寄主植物缓解镉胁迫的芽孢杆菌筛选及其耐镉机制

杨 威， 闫海霞， 汪家璐， 纪丽莲， 王新风

(1.淮阴师范学院生命科学学院/江苏省环洪泽湖生态农业生物技术重点实验室，江苏 淮安 223300;2.淮安市农业技术推广中心，江苏 淮安 223300)

农用土壤是受人类活动强烈影响的一类特殊土壤，其质量与人类健康密切相关［1］。土壤污染源主要来自工业“三废”和农药、化肥，污染物可通过灌溉水进入土壤，也可通过空中的颗粒物(含重金属和致癌物质等)干湿沉降造成土壤污染，随着时间的推移，农田表层土壤镉、铅、铜、锌等重金属含量有增加的趋势［2］。由于农作物的吸收作用，重金属元素从土壤迁移转化到农作物根、茎、叶及果实中去，从而连带造成农作物的重金属污染。全球每年释放到环境中的镉高达 3.9×104t［3］，而在环洪泽湖地区几种重金属污染当中，镉要高于其他几种［4］。如何修复受到镉污染的土地和水体是我们急需面对的问题。

目前，工程修复、电动修复、电热修复、土壤淋洗以及化学修复等方法虽然在一定程度上能够缓解重金属污染，但是却存在着一些弊端，如实施工程量大、投资费用高，破坏土体结构造成土壤肥力下降，并且还要对换出的污土进行堆放或处理，其中化学修复只是改变重金属的存在形态，并不能彻底根除重金属，重金属还有再度活化污染的可能。另外，一些特定植物也可以通过对金属离子的吸收、挥发以及稳定对重金属污染进行修复。这种修复方式虽然效果好、易操作，但是却只能用于非耕作土壤或水体，对于农田重金属污染依然无能无力［5］。

利用从自然环境中分离得到的有益微生物来修复农田及水体的重金属污染就可以克服这一缺点［6］。受到重金属污染的土壤，往往富集多种耐重金属的真菌和细菌，其通过多种作用方式影响土壤重金属的毒性［7-8］。如魏本杰等人报道，产铁载体细菌可以活化土壤中的镉［9］。周小梅等人也发现了一株具有较强产酸能力的芽孢杆菌，该菌株除对镉有耐性之外，对铅、铜等均具有一定耐受性［10］。除此之外，植物内生菌作为与植物关系紧密的重要微生物资源，也在修复重金属污染中发挥着作用。如曹喆等人从重金属镉(Cd)超累积植物龙葵中分离到一株能够去除镉离子的芽孢杆菌［11］。另外，姜敏等人报道从重金属富集植物(大叶相思)与非富集植物(水禾、水稻)中分离到的重金属抗性真菌均高于根际真菌［12］，也说明了内生菌在重金属修复中的巨大潜力。寻找一种能够有效降低环境中镉离子浓度从而减少农作物吸收积累的修复方式，对于日益严重的耕地重金属污染来说意义重大。

本研究拟在离体条件下选择能够耐受并且降低环境中镉离子浓度的菌株，并进行盆栽条件下耐隔菌株的活性评价，初步探讨其降低镉离子浓度的可能机制，旨在寻找一条降低农业生产中镉污染危害的途径。

1 材料与方法

1.1 离体条件下菌株耐镉活性检测

从本实验室菌株资源库中选择了183株细菌，将活化后的菌株接种到含有终浓度为15 mg/L硫酸镉的LB培养液中，28℃，180 r/min摇床培养24 h，对照组不加硫酸镉溶液。分别从培养后的培养液中吸取2.0 ml溶液在600 nm下检测其吸光值，判断菌株生长情况。另取1.0 ml培养液离心后取上清液，在上清液中分别加入9.0 ml去离子水，转移至50.0 ml小烧杯中，加入浓硝酸1.0 ml，80℃水浴，蒸发至1.0 ml左右再加入浓硝酸1.0 ml、高氯酸0.5 ml。混匀后继续水浴蒸发至1.0 ml，冷却，加入4.0 ml去离子水，混匀后利用原子发射光谱法(ICP)测定其中镉离子浓度。

1.2 盆栽条件下耐镉菌株的活性评价

试验共进行2批次，所用寄主分别为黄瓜品种新津优1号和辣椒品种大禹牛角王，穴盘育苗，待苗长出3～4片真叶后移栽到温室盆钵中，每盆1株。盆钵高10 cm，口径12 cm，每盆装基质400～500 g。温室条件设定为30℃，光照时间16 h，黑暗时间8 h。

根据菌株离体条件下耐镉活性筛选结果，选择培养液中镉离子浓度下降率最高的5株菌株进行2批次温室试验。其中根围细菌4株，编号分别为H2-1L、H2-22K、H3-11L 和 L5-2L;内生菌1 株，编号为1JN2。每批温室试验分别设5个处理组，处理方式如下:移栽时用1×109CFU/ml的菌悬液灌根处理，每盆20 ml，移栽7 d后用30 mg/L硫酸镉灌根处理，每盆20 ml。另设2个对照，对照1不接种菌株，移栽7 d后用30 mg/L硫酸镉灌根处理，每盆20 ml;对照2不接种菌株，正常培养。每组重复3次，每个重复24株植株。

1.3 植株生理指标检测

植株移栽后第21 d分别检测各处理组根长、鲜质量、叶绿素含量、根系活力以及叶片相对电导势。检测方法参照《植物生理学实验指导》［13］。

每个处理组随机选取植株3株，准确称取1 g茎，600℃灰化4 h(干法灰化)，1%盐酸洗脱灰分，去离子水定容至5 ml，利用原子发射光谱法测定镉离子浓度。

1.4 耐镉菌株的鉴定

对菌株进行革兰氏染色反应，并观察其形态。采用树脂型基因组试剂盒(赛百盛有限公司生产)提取菌株基因组DNA，以提取的基因组DNA为模板，利用16S通用引物扩增其16S rDNA片段并送南京金斯瑞有限公司测序，结果提交NCBI数据库进行比对。结合比对结果和菌株形态对其进行鉴定。

1.5 耐镉菌株镉离子耐受机制

选择温室试验中协助寄主植物缓解镉胁迫效果最好的菌株进行耐镉机制研究。将浓度为1×107CFU/ml的该菌株菌悬液按照1%接种量接入含有3 g/L硫酸镉的LB培养液中，28℃、180 r/min摇床培养，分别在12 h、24 h、36 h和48 h吸取培养液，离心收集菌体，超纯水洗脱后用2.5%戊二醛固定，通过扫描电镜观察菌株的群体以及单细胞形态。以不加镉离子的处理组作为对照。

2 结果与分析

2.1 离体条件下菌株耐镉活性检测

183株细菌中58株在含有15 mg/L Cd2+的LB培养液中培养24 h后OD600大于0.5，说明在外源镉离子存在的情况下菌株依然能够正常生长。其中22株菌株培养后溶液中Cd2+浓度下降大于10%，下降最高达51%。选择其中5株菌株(H2-1L、H2-22K、H3-11L、1JN2、L5-2L)进行盆栽试验评价其协助寄主植物耐受镉胁迫的能力。

2.2 耐镉菌株的温室评价

与对照1相比(表1)，耐镉菌株处理组能够在镉胁迫下增加黄瓜植株的根长、鲜质量、叶绿素含量以及根系活力，其中菌株1JN2和L5-2L增加效果比较明显，特别是植株鲜质量、叶绿素含量以及根系活力3项指标。菌株1JN2处理组显著降低黄瓜植株叶片的相对电导率。

为了更直接反应耐镉菌株协助寄主植物缓解镉胁迫能力，我们检测了镉胁迫环境下寄主植物对于土壤中镉离子的吸收和积累情况。如表1所示，在缺少耐镉菌株保护情况下(对照1)，1 g黄瓜茎组织中镉离子浓度达到0.1 mg/L，5株耐镉菌株接种均能在一定程度上减少植物对于基质中镉离子的吸收，降低幅度从13.53%到23.43%。

表1 耐镉菌株处理对黄瓜生长指标及体内镉积累的影响Table 1 Growth and Cd accumulation in cucumber inoculated with Cd-tolerant bacterial strains

与对照1相比，菌株1JN2、L5-2L和 H2-22K处理增加了辣椒植株的根长、鲜质量、叶绿素含量以及根系活力，特别是菌株1JN2处理，辣椒植株的根长、鲜质量、叶绿素含量与正常培养的对照2相当，而对根系活力的增加效果则显著高于对照2。菌株H3-11L、1JN2和 L5-2L处理与对照1相比均能够明显降低寄主植物叶片的相对电导率，表现出在镉胁迫条件下对于寄主植物的保护作用。相比于黄瓜而言，5株耐镉菌株降低辣椒植株吸收镉离子的效果更明显，降低幅度从29.64%到40.39%(表2)。

综合2批次温室盆栽试验结果，菌株1JN2在镉胁迫条件下对于寄主植物的综合保护效应更佳。

2.3 耐镉菌株鉴定

菌株1JN2呈革兰氏染色反应阳性，通过形态学与16S rDNA序列比对鉴定为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)。

表2 温室条件下耐镉菌株处理对于辣椒生长指标及体内镉积累的影响Table 2 Growth and Cd accumulation in pepper inoculated with Cd-tolerant bacterial strains

2.4 耐镉菌株的扫描电镜观察

根据扫描电镜结果，与对照组相比，在培养液中加入镉离子之后，菌株1JN2的胞外多糖黏度增强，且洗脱后胞外多糖残留较多。镉离子处理组在12 h时菌体受到明显损伤，出现外壁内陷。但是这种现象从24 h开始有一定程度缓解，菌体开始自我复原，至48 h，菌体已经基本恢复到原有状态(图1A～1D)。说明此时菌株已适应镉离子的存在，并且能够进行正常生长代谢。第48 h时，处理组的胞外多糖开始发生形态上的变化，由最初的絮状开始固化，形成片层状固态(图1E)。

图1 菌株1JN2在镉离子处理后群体和单细胞的形态Fig.1 The morphology of population and single cell of Cd-treated strain 1JN2

3 讨论

植物内生菌［14］和号称植物“第二基因组”［15］的植物根围细菌在寄主植物生长过程中发挥重要作用。这些微生物不仅能够协助寄主植物阻止病原菌的入侵［16］，为植物生长提供必要的营养［17］，还能协助寄主抗逆，包括抗旱、耐盐碱以及耐重金属污染等［18-21］。

与以往的报道中发现内生菌在重金属抗性方面的优势［12，22］类似，本研究筛选出的一株植物内生菌1JN2，在离体条件和温室盆栽试验中均表现出显著耐镉活性，并降低植物体内镉离子的吸收累积，且活性显著高于植物根围细菌。该菌株能够逐渐适应镉胁迫压力，在处理24 h后开始进行菌体的自我复原。从胞外多糖的形态来看，推测该菌株可能利用胞外多糖固定环境中的镉离子，从而减少寄主植物对于镉离子的吸收。在前期的研究中我们还发现菌株1JN2同时具有产IAA以及多种胞外酶的活性，能够协助寄主植物防控土传病害的侵染［23］。在农业生产环境不断恶化的大背景下，该菌株表现出一定的开发潜力。在今后的研究中，我们将重点研究其耐镉机制、发酵条件优化以及剂型开发等，为农业安全生产提供保障。

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