四川省家犬狂犬病免疫抗体监测

侯 巍，邓永强，阳爱国，郭 莉，文 豪，陈 冬

（四川省动物疫病预防控制中心，四川 成都 610041）

狂犬病是由弹状病毒科的狂犬病毒引起的一种人畜共患急性传染病。该病可以引起人和多种动物致死性的中枢神经系统感染[1-2]。在我国，狂犬病的主要宿主动物与传染源是犬。为了解四川省犬只免疫接种情况和抗体产生情况，有效制定狂犬病防控措施，笔者一行对四川省14个市州的258条犬进行了狂犬病免疫抗体监测。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 对照血清。标准狂犬病阳性血清、标准狂犬病阴性血清，由ELISA试剂盒厂家提供。

1.1.2 待检血清。来自四川省南充市、绵阳市、广元市等14个市州的258头份犬只血样。

1.1.3 诊断试剂。酶联免疫吸附试剂盒购自荷兰EVL公司。ELISA试剂盒包括：96孔包被灭活全病毒酶联板、酶标条支架、HRPO酶标抗体、洗液（200倍浓缩）、ELISA缓冲液、底物缓冲液、终止液、封口膜。

1.1.4 仪器设备。全自动酶标仪（Biorad），美国产；多通道加样器（EPPENDORF），德国产；单道加样枪（EPPENDORF），德国产。

1.2 试验方法

1.2.1 采血。2013年2～8月采集各市州犬只血清样本，共采集14个市州（南充、绵阳、广安、乐山、凉山、巴中、宜宾、雅安、资阳、攀枝花、广元、泸州、内江、遂宁）的血清样本258份。

1.2.2 分离血清。将所采集的血样置37℃恒温箱中温浴30min，再经2000r/min离心5min，静置后分离血清，-20℃保存备用。

1.2.3 酶联免疫吸附试验。将酶标板内的液体清空，清洗4次，除去孔内的残液，取100μL稀释100倍的样品加入孔内，37℃孵育60min。每板设两孔阴性对照，两孔阳性对照。以1∶200的比例将洗涤液稀释，然后每孔加入250μL进行洗涤，重复4次（最后一次倾倒后要拍干）。再在每孔中加入100μL特异性酶标结合物，封板，37℃孵育60min。

以1∶200的比例将洗涤液稀释，每孔加入250μL进行洗涤，重复4次（最后一次倾倒后要拍干）。然后在每孔加入100μL底物（缓冲液A和缓冲液B等体积混合），室温（21℃）下孵育15min。最后在每孔加入终止液50μL，10min内用酶标仪检测其OD450nm值。

2 结果判定

2.1 试验有效性 阳性对照OD450nm≥1.000；阴性对照 OD450nm<0.350，终点滴度≤50。

2.2 结果判定方法 如果样品的OD值比阴性对照的OD值大0.200以上，则样品为阳性。

3 试验结果

14个市州的犬只抗体总阳性率为20.9%，各市州的阳性率在25%～50%之间，其中有3个市州的血清阳性检测率为0。

3.1 抗体的地域分布 将采自四川省14个市州的犬只血清样品共258份统一编号，统计后进行抗体检测。结果：血清抗体阳性率分别为24%、23%、50%、59%、0、5%、50%、30%、10%、40%、0、0、30%、15%。

3.2 群体的抗体阳性率 本次试验共采集四川省犬只血液样品258头份，抗体总阳性率为20.9%。

4 讨论

4.1 采样及样品处理的科学性 本试验所采集的258份犬只血液样品来自四川省14个市州，充分考虑到了血液样品的地域分布和样品的代表性。另外，由于不同犬只产生抗体的时间会有所不同，故所有的血液样本采集时间从2月到8月不等，期间跨越7个月时间（犬只免疫一般是在春季），并作了详细的记录和编号。

4.2 抗体阳性率 本试验共采集犬只血清样品共258份，经检测，抗体总阳性率为20.9%。由此判断四川省犬只的狂犬病免疫率低，需重新加强免疫。

4.3 诊断方法的选择 对犬只狂犬病的诊断，不同的情况选用不同的诊断方法。未用疫苗免疫过的发病犬，只用免疫荧光试验或内基氏小体检查，血清为阳性即可确诊；对于免疫过的犬只抗体检测，需采用酶联免疫吸附试验来确诊。

4.4 免疫率低的原因分析

4.4.1 疫苗经费缺乏，犬只免疫工作不到位。未进行免疫的犬只，不能刺激犬机体免疫系统产生免疫应答，也就不能产生有效的抗体。四川省是养犬大省，犬只数量多，约为600多万条，因此给免疫工作带来了很大的难度。另外，国家尚未启动狂犬病专项经费项目，四川省的狂犬病专项经费较少，每年只有50万元购买狂犬病疫苗，不够1/3的犬只免疫。地方财政好的地方可以自行解决部分疫苗经费，而地方财政差的市州则没有多余的经费购买疫苗，这是免疫率低的重要原因。

4.4.2 对狂犬病免疫监测工作的重视不够。狂犬病的病死率极高，每年狂犬病的病死率居我国死亡病种前列。我国对动物狂犬病防治工作的重视不够，其主要原因是相关兽医管理部门未清楚地认识到动物狂犬病防治是控制人狂犬病发生的关键和必要前提，更没有将犬只的狂犬病免疫作为工作重点。目前，国内对狂犬病易感动物的免疫预防与监测工作开展不到位，也是狂犬病疫情得不到控制的又一原因。

4.4.3 疫苗质量问题。疫苗效价越高，其免疫效果越好，目前市场上已有多家动物狂犬病疫苗，难免因各厂家的生产工艺、所用种毒、细胞、疫苗保护剂及冻干条件不同而使疫苗的质量出现差异。质量较差的疫苗注射到犬体之后，或表现免疫不良，或表现发病。另外，即使是质量较好的疫苗，在贮存、运输、使用过程中若不注意正确的使用方法（特别是稀释溶解后的疫苗，短时间内稳定性即可大大降低），也可使疫苗滴度降低，造成免疫失败。

[1]王功臣，马世春.兽医公共卫生[M].北京:中国农业出版社，2011:45-47.

[2]谢世宏，陈科文.狂犬病防制指南[M].成都:四川科学技术出版社，1992.