空间生命科学共焦显微图像采集系统*

鞠洪伟，张 涛，郑伟波，蔡 萍，刘方武

（1.中国科学院 上海技术物理研究所，上海 200083;2.中国科学院大学，北京 100049）

0 引言

空间生命科学实验中在轨实验数据的获取、样品的实时监测与分析主要依靠生命科学仪器完成，而空间生命科学实验用显微镜作为实验过程记录和结果分析的可视化工具，是空间生命科学仪器的重要组成部分。目前，对生物样品的显微观测手段主要包括普通光学显微、荧光显微以及共焦显微等。共焦显微技术作为现代生命科学研究重要的检测手段，通过共焦光路和扫描技术实现对探测点的高分辨率扫描成像［1，2］，配合轴向步进，可以完成样品的光切，得到三维图像。近年来，NASA成功研制共焦显微模块，并组合到光学显微模块（light microscopy module，LMM）中，用于在轨的微重力液体、物理和生物实验中的样品显微观察。

随着生命科学的飞速发展，生命科学实验涉及的范围越来越广，而空间生命科学实验中需要显微观察的生物样品可能具有活性和移动性等特点，所以，空间生命科学实验中针对活体目标进行观察的需求日益紧迫，而传统的点式扫描共焦显微镜基于逐点扫描探测成像原理，往往在512×512图像分辨率下，扫描成像时间在s级，很难在图像帧频上达到活体观察要求。在逐点扫描方式中，每点的驻留时间很短，如要完成1 frame/s（512×512）的成像速度，激发光在每点的驻留时间只有4μs，要想在这么短的时间内激发出探测器能够探测到的荧光，就必须加大激发光的功率，这样就会对样品造成一定损伤。而应用扫描盘进行全视场同时扫描的共焦显微系统同时激发约1000个针孔，扫描帧频可以达到几百赫兹，配合面阵弱光探测成像装置，图像帧频可以达到活体观察需求。由于扫描盘瞬间通过多个针孔激发样品，所以，在每点的等效驻留时间要长得多，这就可以降低激发光的功率，继而降低系统的光毒性和光漂白效应，所以，基于多针孔扫描盘的快速共焦显微系统更适用于空间生命科学实验中长时间的活体目标观察。目前各种荧光共焦显微镜中应用较为成熟弱光探测器包括:光电倍增管（PMT）、雪崩二极管（APD）;多元面阵器件包括:高灵敏制冷CCD、微通道板或像增强CCD（ICCD）、电子倍增CCD（EMCCD）等。

1 共焦显微原理与系统方案

基于针孔式扫描盘建立的快速共焦显微系统的结构如图1所示，激发光源发出的光经过准直、扩束之后，透过分光镜，依次经过快速扫描盘和显微物镜。物镜汇聚的激发光照射在样品上，样品受激发射的荧光按照原光路返回，当发射荧光经过快速扫描系统时，被滤去物方非焦面发射的杂散光。分光镜反射的荧光经过透镜汇聚后被CCD接收，获取样品共焦显微图像。通过控制样品在Z轴上步进，进而改变样品的光切位置，可以获得样品不同切面的图像，最终通过一定的图像处理技术可以获得样品的三维图像。

图1 快速扫描共焦显微系统结构Fig 1 Structure of fast scanning confocal microscopy system

2 EMCCD相机结构与组件内容

图1所建立的共焦显微系统以针孔盘作为扫描部件，它以多点针孔同时对视场进行扫描，因此，图像采集器件宜采用面阵器件，综合探测灵敏度、图像输出帧频、空间应用等角度考虑，系统采用EMCCD作为图像采集器件。它与传统CCD器件在感光、存储等结构上并无差异，之所以在探测灵敏度、信噪比上表现出色，是因为在其读出寄存器之后又多出了一串增益寄存器，增益寄存器的单个倍增单元如图2所示。与普通的三相CCD转移电极相比，EMCCD将Ф2分为Ф2和Фdc，一般Фdc接2 V左右的直流偏置，Ф2接高压（40 V左右）转移时钟，由于Ф2与Фdc之间存在高压差，当信号电荷从Ф1向Ф2转移时，强电场会使电荷加速并与其他电荷碰撞产生新的电子，电子被Ф2势井收集实现1次信号倍增。单个倍增单元的倍增率是随机的，一般在1% ～1.5%范围内，虽然单个倍增单元增益很低，但当多个倍增单元级联时，总增益由式（1）确定

其中，g为单个倍增单元的倍增率，n为倍增单元数，当n取500时，总增益可能达2000倍以上。

图2 单个倍增单元结构Fig 2 Structure of single multiplier unit

系统采用英国E2V公司的CCD97器件作为成像探测器［3］，CCD97是减薄背照式帧转移型 EMCCD，具有512×512有效像素，像素尺寸为16 μm×16 μm，它同时具有普通模式与倍增模式成像方式，相应具有两路读出放大器。倍增模式下制冷到-40℃，可达30 photons/pixel/s（积分时间为0.1 s）的探测能力，满足弱光探测需求，同时在11 MHz像素时钟下，噪声低于1电子/pixel，量子效率达90%以上，满足高帧频需求。

整套系统的电子学设计围绕EMCCD的驱动需求展开，按功能主要划分为3个模块:逻辑驱动模块、功率驱动模块和上位机图像采集模块，系统功能框图如图3所示。

图3 EMCCD相机功能结构Fig 3 Functional structure of EMCCD camera

2.1 逻辑驱动模块

逻辑驱动模块主要完成EMCCD帧转移、行转移、行输出等逻辑信号输出、AD时序控制输出、SRAM时序控制输出以及图像数据串行输出等功能，逻辑模块核心器件采用ACTEL公司的APA300器件，它基于Flash技术，无需配置芯片，功耗低，对固件错误有较好的免疫作用，可以抵御一些高能粒子的冲击，最大优势在于在特殊环境下可以稳定可靠地工作，适合航天领域的应用。图像信号采集部分用AD9824，它是ADI公司一种专用于CCD信号处理的AD器件，它包含14位精度最高采样率为30MSPS的A/D转换器，芯片内部集成了相关双采样电路、像素增益放大器、可编程增益放大器。逻辑驱动模块的硬件程序各子模块的调用关系如图4所示。

图4 硬件程序结构Fig 4 Structure of hardware program

2.2 功率驱动模块

CCD97的驱动除了对信号相位要求严格外，还要求信号电平和上升时间多样化，针对不同信号的电平和上升时间需求，功率驱动模块采用4种电路方案，包括偏置电平电路、图像转移信号电路（ФIS，ФR）及高压时钟电路。

由于CCD97直流偏置所需电流不大，所以，偏置电平电路采用电阻分压与运放跟随实现。图像转移信号上升时间较短，需要较大的驱动电流，图像帧转移、行转移、行输出信号功率驱动电路以EL7457作为核心器件。它是Elantec公司推出的四通道CMOS专用驱动器，最高工作频率可达40 MHz，最大驱动电流2A，具有低输出阻抗、外围电路简单、方便电源管理等优点，非常适用于多电平复杂时序的CCD器件驱动设计。

图像转移信号功率驱动电路如图5所示［4］，由于ФI，Φs，ФR信号的上升时间要求不同，实际调试电路时选择合适的电阻器（R1～R5）使得信号上升时间尽量满足器件需求，保证输出的图像质量较高。

图5 图像转移信号驱动电路Fig 5 Image transfer signal driving circuit

高压时钟是实现倍增模式成像的关键信号，它的电平决定了倍增增益，并最终影响器件在低照度下的成像效果。由于高压时钟的电平较高，一般在40 V左右，驱动电流100 mA左右，使用集成元件很难实现，所以，高压时钟电路采用分立元件实现，电路如图6所示［5］。

图中电路的静态偏置由二极管 D1，D2，D3，D4，D5，D6以及电阻器R1，R3，R4所组成的分压网络提供。Q1的栅源极静态电压约为-1 V，Q2的栅源极静态电压约为1 V。当FPGA驱动脉冲为低时，U1和U2的输出为5V，Q1的栅源极电压为-1 V，Q2的栅源极电压为6 V，此时，Q1关断，Q2导通，Φ2HV被拉低到0V;当FPGA脉冲为高时，U1和U2的输出为0V，Q1的Vgs为-6 V，Q2的Vgs为1 V，此时Q2关断，Q1导通，Ф2HV被拉高到电源电压Vhigh。Ф2HV的输出相位与FPGA输出逻辑信号相同，高低电平与高压电源一致。

图6 高压时钟驱动电路Fig 6 High-voltage clock driving circuit

2.3 上位机软件

上位机控制软件主要负责指令编码、指令下传以及图像数据接收、图像数据存储、图像显示等工作。

上位机软件开发环境为VC++6.0，通过调用操作系统自带的MScomm控件完成指令下传与数据接收。通过点击界面上的“打开串口”按钮建立相机与上位机间的通信，点击“打开相机”按钮完成相机参数与开机指令下传，开启图像数据接收线程，待正确接收数据包头并完成一整幅图像数据接收后，显示接收图像并保存图像数据。

3 图像采集验证与分析

验证实验镜头采用MV2514机器视觉镜头，该镜头放大倍率为0.23倍，焦距为25 mm，F数可小至1.4，可见光波段内透过率约90%，机械接口为标准C接口，可兼容2/3 in CCD，最小工作距130mm。实验中采用6mm特写环在0.01 lx微光、100 ms积分时间、2 dB增益条件下使用普通模式与倍增模式分别对同一目标成像，图像如图7所示。

图7 普通模式与倍增模式图片Fig 7 Normal and multiplication mode image

从获得的暗背景条件下的图像数据可计算出噪声平均灰度值与方差，分别选择普通模式下与倍增模式下目标图像的最亮点作为信号，取多幅图像数据的亮点信号并计算平均值，可以获得普通模式下与倍增模式下的信噪比，列于表1。

表1 实验对比数据Tab 1 Contrast data of experiment

从表中可以得出:相比普通模式，在44 V倍增时钟电压驱动下，倍增模式输出图像的信号有7倍提升，信噪比也有8倍提升，证明CCD97在微弱光条件下，使用倍增模式可以获得较高质量的目标图像。

根据图1搭建共焦显微系统，使用40倍物镜对拟南芥进行荧光显微成像。普通显微模式与共焦显微模式分别对样品所成图像如图8所示。

EMCCD相机倍增模式与普通模式使用相同AD增益，积分时间分别取100，50 ms。从图8可以看出:EMCCD在倍增模式下可以获得比较清晰的拟南芥叶肉共焦显微荧光图像。相比普通显微模式，由于对样品进行光切的原因，使得系统在共焦显微模式下可以清晰的分辨出拟南芥叶肉叶绿体。

图8 拟南芥叶绿素荧光图像Fig 8 Fluorescence image of chlorophyll

4 结论

通过对空间生命科学实验中共焦显微的原理分析，提出一套适用于活体目标观察、对样品低损伤的共焦显微方案。根据目标的扫描方案和获取目标发射光的能量大小提出基于CCD97的弱光图像采集系统，将系统分成3个功能模块分别实现并最终完成原理样机研制。在普通模式与倍增模式下分别获取目标图像，从图像效果可以看出:该成像系统性能较高，对弱光目标有很好的成像效果，且该系统具有体积小、可靠性高、适合空间应用等特性。

［1］Gu Min.共焦显微术的三维成像原理［M］.王桂英，陈 侦，杨莉松，译.北京:新时代出版社，2000:14-51.

［2］Colin J R Sheppard.Aberrations in high aperture conventional and confocal imaging systems［J］.Applied Optics，1988，27（22）:4782-4786.

［3］E2V Technologies inc.CCD97—00 back illuminated 2-phase IMO series electron multiplying CCD sensor［EB/OL］.［2004—05—11］.http://www.e2vtechnologies.com.

［4］孙 静，张保平，曹睿学.基于EMCCD的驱动电路设计［J］.现代电子技术，2011，34（4）:150-154.

［5］Texas Instruments.TC285SPD—B0 1004 ×1002 pixel impactron CCD image sensor［EB/OL］.［2004—05—31］.http://www.ti.com.