Pb2+生物传感器的研究综述

张瑞英，陈龙聪，张婷婷，熊兴良

（重庆医科大学生物医学工程研究室，重庆 400016）

0 引言

近年来，随着工农业和经济的迅速发展，水环境中Pb污染日益加剧，由此造成的Pb中毒事件更是层出不穷。Pb是一种稳定的不可降解的污染物，可通过皮肤、消化道、呼吸道进入人体，积蓄到一定的量就会导致贫血症、神经机能失调、肾损伤和脑损伤等。此外，Pb对儿童的影响最大，儿童血Pb2+浓度达到0.483 μmol/L时，就会影响其大脑发育造成智力障碍。因此，美国环境保护署规定饮用水中Pb2+的最大含量不得超过72 nmol/L。

传统的Pb2+检测方法，如电感耦合等离子体质谱法（inductively coupled plasma mass spectrometry，ICP-MS）、阳极溶出伏安法（anodic stripping voltammetry，ASV）、原子吸收光谱法（atomic absorption spectrometry，AAS）等，虽然检测灵敏度高，但是存在仪器昂贵、样品预处理复杂、需要专业人员操作等缺点。因此，人们迫切的需要一种快速、准确、低成本的现场实时Pb2+检测技术。比色、荧光、电化学传感器满足上述要求，并在现场检测与应急处置方面展现出很好的应用前景。本文综述了这3种Pb2+生物传感器的研究现状，指出其存在的问题，并展望其发展方向。

1 比色传感器

比色传感器是以生成有色化合物的显色反应为基础，通过比较或测量有色物质溶液颜色深度来确定待测组分含量的方法。在重金属离子检测中，近年最常用的显色物质为金属纳米颗粒，尤其是Au纳米颗粒（Au nanoparticles，AuNPs）。AuNPs是尺寸为1～100nm的Au颗粒，由于其具有高摩尔消光系数、独特的局部表面等离子共振特性和易于表面功能化等优点，被广泛地应用于比色传感中［1］。其检测原理如图1:AuNPs表面固定Pb2+识别分子，由于颗粒为分散状态而呈红色;当Pb2+存在时，Pb2+与识别分子之间的结合导致AuNPs聚集，引起AuNPs局部表面等离子共振发生变化，溶液从红色变为蓝色或紫色。识别分子决定了检测的特异性。

1.1 以生物分子或有机小分子作为识别分子

根据含有巯基、羧基、氨基的生物分子与Pb2+存在配位络合作用，利用Au-S键或Au-N键固定或吸附在AuNPs表面，制成 Pb2+比色传感器。如谷胱甘肽（glutathione，GSH）含有2个羧基和1个氨基，可以和Pb2+结合。Chai F等人［2］用 GSH 修饰 AuNPs，加入 Pb2+后，由于 Pb2+和GSH结合，AuNPs迅速聚集，溶液颜色从红色变为蓝色，其检测下限为100 nmol/L。木瓜蛋白酶含7个半胱氨酸残基，可以和 Hg2+，Pb2+，Cu2+结合，Guo Y 等人［3］用木瓜蛋白酶修饰的AuNPs设计了一种同时检测Hg2+，Pb2+，Cu2+的比色传感器，该方法对这3种离子的检测下限均达到500 nmol/L，不过需要指出的是，该方法难于实现单一离子的检测，且灵敏度有待提高。

有机小分子也常被用作Pb2+的识别分子，如Yoosaf K等人［4］根据没食子酸（gallic acid，GA）的酚羟基可以和Pb2+发生配位结合，利用GA修饰的AuNPs检测Pb2+。该传感器用GA做还原剂将氯金酸中的Au3+还原成Au0生成GA修饰的AuNPs，避免了柠檬酸还原法制备AuNPs时加热煮沸等耗时的步骤，该传感器的检测下限为5 nmol/L。此外根据Pb2+在碱性溶液中易生成Pb（OH）3-，可以与羧基较强的结合，Guan J等人［5］用柠檬酸修饰的 AuNPs，在pH为11.2时，对Pb2+进行检测。此时溶液中羟基浓度增加，抑制了其他离子和柠檬酸中羧基的结合，从而实现对Pb2+的特异性检测，其检测范围为0.2 ～15 μmol/L。

图1 AuNPs比色传感器检测Pb2+原理图Fig 1 Principle diagram of AuNPs colorimetric sensor for detection of Pb2+

1.2 以DNA为识别分子

以生物分子或有机小分子作为识别分子的Pb2+比色传感器虽然在灵敏度上满足了实际应用的要求，但大多数还存在选择性差的问题。由于DNA具有如高亲和力、易于合成、化学稳定性，能快速固定在固体表面等优点，近年来提出了以DNA作为识别分子的Pb2+比色传感器。如“8-17”DNAzyme（包括酶链和基底链），Pb2+可以和酶链特异性结合，激活酶链的活性，裂解基底链（含活性酶链的切割位点）。Liu J W等人［6］以“8-17”DNAzyme作为识别元件、以AuNPs作为传感元件设计了一种Pb2+比色传感器。“8-17”DNAzyme通过基底链两端和AuNPs表面修饰DNA片段的碱基配对，使AuNPs聚集;当加入Pb2+时，DNAzyme的基底链被裂解，酶链释放，从而导致AuNPs分散，颜色从蓝色变成红色。该方法检测下限为100 nmol/L。利用DNAzyme存在着2个缺点:冗长的分析时间和所需系统温度的改变。此外，莫志宏等人［7］利用Pb2+与富含G的核苷酸序列形成稳定的Pb2+-G-四联体结构，将富含G的核苷酸序列修饰到AuNPs表面，设计了一种Pb2+传感器。当加入Pb2+时，AuNPs表面的核苷酸形成了G-四联体结构，导致AuNPs聚集，溶液变色。该方法检测下限为20 nmol/L，但是其选择性不好，易受Hg2+的干扰。

与其他方法相比，比色传感器的最大优势在于检测结果只需要裸眼观察，不需要其他先进的配套仪器，操作简单，因此，吸引了众多研究者的目光［8］。

2 荧光传感器

荧光传感器是以荧光信号为检测对象，通过荧光增强、猝灭，或者发射波长的移动，进行定性或定量分析的方法。用于Pb2+检测的多为荧光适配体传感器，其中适配体是经过体外筛选得到的寡核苷酸序列，能与相应的配体进行高亲和力和高特异性结合。荧光适配体传感器通常分为“荧光打开”和“荧光关闭”2种方式［9］，主要是用荧光基团标记适配体，基于目标分子和适配体作用后产生荧光偏振或荧光强度的改变检测目标分子，或者将荧光基团和猝灭基团分别标记在适配体上，通过目标分子引入体系中引发荧光信号改变分析待测物。

Kim J H等人［10］设计了一种基于DNAzyme和 AuNPs的“荧光打开”Pb2+生物传感器。根据AuNPs具有抗氧化性、低荧光背景和高猝灭效率等优点，该传感器用AuNPs代替有机猝灭剂，克服了先前DNAzyme荧光传感器的不完全荧光猝灭、需要对DNAzyme和基底进行退火处理，并且需要移除不耦合的基底等缺点。如图2所示，将荧光标记的Pb2+特异性结合物质DNAzyme的基底链修饰到AuNPs表面，不存在Pb2+时，荧光供体和AuNPs发生荧光共振能量转移，荧光猝灭;加入Pb2+后，酶链活性被激活，将基底链裂解成两部分，阻止了荧光共振能量转移的发生，荧光信号增强，该传感器检测下限达到5 nmol/L。

图2 基于“荧光打开”的Pb2+检测原理图Fig 2 Principle diagram of Pb2+detection based on“fluorescence turn on”

Zhan S S等人［11］用羧基荧光素标记富含G的寡核苷酸序列T30695设计了一种基于“荧光关闭”的Pb2+生物传感器，其中T30695是一种Pb2+特异性识别分子。如图3所示，当没有Pb2+时，T30695呈现自由卷曲状，并且伴随着强烈的荧光强度，当加入Pb2+时，T30695形成了Pb2+稳定的G-四联体，使荧光素和Pb2+之间发生了荧光共振能量转移，导致了明显的荧光猝灭现象。该方法对Pb2+的检测下限为3.8 nmol/L。此外，根据荧光物质ZnPP-IX（锌原卟啉—9）可以和G-四联体结合，增强其荧光强度，而不能与双链DNA发生这种作用，Li T等人［12］报道了一种Pb2+荧光传感器:在T30695和其部分互补序列组成的双链DNA和Zn-PP-IX溶液中加入Pb2+，双链被打开，Pb2+和T30695形成G-四联体，然后与ZnPP-IX发生结合，荧光打开;当加入一种强的 Pb2+螯合剂 DOTA（1，4，7，10—四氮杂环十二烷—1，4，7，10—四乙酸）时，Pb2+和 DOTA 结合，DNA 又变成双链结构，ZnPP-IX释放到溶液中，荧光消失。该传感器可重复使用，检测下限为20 nmol/L。

图3 基于“荧光关闭”的Pb2+检测原理图Fig 3 Principle diagram of Pb2+detection based on“fluorescence turn off”

荧光适配体传感器具有灵敏度高，分析线性范围宽，特性参数较多，选择性更好等优点，但是，荧光标记中常用的荧光染料如荧光素、罗丹明等仍然具有局限性，如荧光强度较低、易被光漂白，限制了其应用的灵敏性，因此，在荧光染料的选择方面应加以改进［13］。

3 电化学传感器

电化学传感器是依据电化学分析方法和原理构建的，通过测定溶液中电流、电位、电量等物理量来确定参与反应的化学物质的量。基于DNA修饰电极的电化学传感器是Pb2+检测的研究热点［14］，主要是利用自组装方法将Pb2+特异性识别DNA分子探针固定到电极表面，通过DNA和Pb2+作用造成的DNA构象的变化，使得DNA分子上电活性基团的电化学响应发生变化，实现Pb2+的高灵敏检测。

Li F等人［15］根据目标物导致DNA链的释放提出了一种高选择性、高灵敏度脉冲电流检测Pb2+的方法。如图4所示，首先通过直接沉积法将AuNPs修饰在Au电极表面，增大电极表面积，增加固定的DNA捕获探针数量。DNA捕获探针和T30695杂交形成双螺旋结构，亚甲蓝MB（一种芳香杂环，常用做电化学杂交指示剂）可以通过嵌入与双链DNA结合，形成可测的电化学信号。当加入Pb2+时，Pb2+和T30695形成G-四联体结构，使T30695从电极表面释放到溶液中，并伴随着亚甲蓝的释放，导致电信号减弱。该传感器的检测下限达0.075 nmol/L，灵敏度高，选择性好。

除了运用修饰电极外，Zhuang J等人［16］基于DNAzyme和二茂铁标记的DNA发卡的杂交链反应设计了一种磁控电化学Pb2+传感器。该传感器是将 Pb2+特异性结合DNAzyme作为识别元件修饰到在磁珠上，当加入Pb2+时，基底链被催化裂解，导致磁珠上的酶链通过碱基互补启动链捕获。启动链的捕获触发了二茂铁标记的交替的发夹结构DNA的杂交链反应并在磁珠上形成一个带有缺口的双螺旋结构。大量的二茂铁分子聚集在探针上，并且伴随着电化学信号的变化。最佳化条件下，随着Pb2+浓度的增加，该Pb2+传感器的电化学信号也增加，并且和Pb2+浓度在0.1～75 nmol/L内呈线性比例，检测下限为37 pmol/L。

基于DNA修饰电极的Pb2+电化学生物传感器具有较高的检测灵敏度，甚至达到pmol级，但是这类传感器中也存在一些问题，例如:单链DNA与其他非目标物质结合会形成杂交假象，干扰目标物质的检测，另外受温度影响较大。

表1列出了其他的一些基于上述3种方法的Pb2+生物传感器。

表1 其他的基于比色、荧光、电化学方法的Pb2+生物传感器Tab 1 The other Pb2+biosensors based on colorimetric，fluorescence，electrochemistry method

其中，rGO-SPCE为基于石墨烯修饰的丝网印刷碳电极。

4 结束语

本文综述了近年来比色、荧光、电化学3种Pb2+传感器的研究现状。这3种传感器在Pb2+的检测中各具优缺点，荧光法和电化学方法较比色法灵敏度更高，但是前2种方法由于需要仪器辅助，故不适合于现场应用。比色法由于操作简单且无需辅助仪器，是一种非常适合现场筛查和应急使用的潜在方法［27］。鉴于灵敏度不高和选择性不佳的缺点，今后应从2方面加以改进:一方面针对选择性问题，应选择对Pb2+具有高特异性的识别分子，如，应用于荧光和电化学传感器的Pb2+特异性结合的富含G的核苷酸序列（T30695，PS2.M 等［28］）可推广的比色传感器中，或通过化学合成获得对Pb2+具有高选择性的有机分子。另一方面，对于灵敏度的提高，可以考虑引入一些信号增强物质，如，液晶、磁珠等，或将多种方法相结合，例如:与动态光散射结合可以显著提高比色传感器的灵敏度［29，30］。因此，通过对现有传感器的不断完善，开发出灵敏度更高、选择性更好，更适合于现场实时监测的便携式低成本微型化传感器是未来的发展方向。

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