血管内皮生长因子对软骨细胞凋亡的作用

朱世振+邱波+高明勇+宋其合+门海龙

[摘要] 目的 探讨血管内皮生长因子（VEGF）对软骨细胞凋亡的影响。 方法 乳鼠关节软骨细胞体外培养成功后，实验分为三组。每组加入不同处理因素进行干预，对照组：不加任何处理因素；VEGF组：VEGF 10 ng/mL；白介素（IL）-1β组： IL-1β 10 ng/mL，连续培养48 h。采用流式细胞仪检测软骨细胞的凋亡率，采用蛋白免疫印迹法（Western Blot）检测增殖细胞核抗原（PCNA）蛋白的表达，通过硝酸还原酶法检测上清液中一氧化氮（NO）的含量。 结果 软骨细胞的凋亡率VEGF组[（9.28±2.35）%]及IL-1β组[（17.14±5.07）%]明显高于对照组[（2.83±0.77）%]；软骨细胞PCNA蛋白表达VEGF组（0.86±0.24）及C组（0.72±0.05）明显低于对照组（1.01±0.11）；软骨细胞分泌的NO含量VEGF组[（112.31±12.73）μmol/L]及IL-1β组[（150.02±15.34）μmol/L]显著高于对照组[（49.35±6.68）μmol/L]，差异均有高度统计学意义（P < 0.01）。 结论 VEGF能够介导软骨细胞凋亡，抑制软骨细胞的增殖活性。

[关键词] 血管内皮生长因子；骨关节炎；软骨细胞；凋亡

[中图分类号] R684.3 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2014）12（a）-0004-04

骨关节炎（osteoarthritis，OA）是以关节软骨细胞凋亡和细胞外基质进行性降解为主要病理特征的疾病。OA的病因尚不完全清楚，研究证实OA受累软骨和滑膜中已发现多种血管生成介质，其中血管内皮生长子（vascular endothelia growth factor，VEGF）是血管生成的主要调节因子，探讨VEGF在关节软骨中退变的作用，特别是以VEGF为靶向的骨关节炎疾病的治疗是研究的热点之一。本实验探讨VEGF对软骨细胞凋亡，以及对增殖细胞核抗原（proliferating cell nuclear antigen，PCNA）表达和一氧化氮（nitric oxide，NO）含量的影响，为今后以VEGF为靶点治疗骨关节炎提供新思路。

1 材料与方法

1.1 实验材料

武汉大学医学部实验动物中心提供的出生1周龄的SD级乳鼠10只，雌雄不分，体重（100±10）g。DMEM/F12培养基（Gibco），胎牛血清（美国Hyclone公司），胰蛋白酶、Ⅱ型胶原酶（美国Sigma公司），细胞总蛋白提取试剂盒（武汉谷歌生物），PCNA一抗，Annexin-FITC细胞凋亡试剂盒，NO检测试剂盒（南京建成生物工程研究所）。

1.2 实验方法

1.2.1 软骨细胞的体外培养和分离 将乳鼠处死后，75%乙醇浸泡，取其膝关节软骨，并无菌条件下移至加有10%胎牛血清的培养基中，剪碎至1 mm3大小，依次用0.25%胰蛋白酶37℃消化40 min，1000 r/min离心5 min后，弃上清，用PBS洗3遍，再加入0.2%Ⅱ型胶原酶，37℃消化2 h，细胞接种于DMEM/F12培养基，并补充100 mL/L胎牛血清，100 U/mL青霉素和100 μg/mL链霉素，密度为2×105接种于培养板，置于CO2培养箱中培养，待细胞70%～80%融合后，培养基中分别加入不同干预因素。实验分三组，对照组：不加任何处理因素；VEGF组：10 ng/mL VEGF；C组：10 ng/mL IL-1β，每组设4个复孔，连续培养48 h进行检测。

1.2.2 流式细胞技术检测软骨细胞凋亡 用0.25%胰酶将各组贴壁细胞从培养板上消化并分别收集至2 mL EP管中，将各组细胞用1 mL PBS洗涤一遍，最后各组分别加入5 μL Annexin-FITC、10 μL碘化丙啶，室温避光孵育15 min，上机检测，重复5次。

1.2.3 Western Blot法检测软骨细胞PCNA的表达 6孔板铺软骨细胞2×105孵育过夜，加入以上干预因素，24 h后，加入细胞裂解液100 μL裂解细胞，按常规的Western Blot操作方法进行，冰上裂解5 min，12 000 r/min离心5 min，取上清行BCA蛋白定量；取样品约10 μg行SDS-PAGE电泳，将蛋白转到PVDF膜，5%脱脂奶粉室温封闭1 h，加入一抗（兔抗PCNA单克隆抗体，1∶1000），4℃过夜；PBS漂洗3次每次10 min，加入HRP标记羊抗兔二抗（1∶3000），室温孵育1 h，漂洗3次，用ECL显色液曝光，灰度扫描仪进行定量分析。

1.2.4 硝酸还原酶法检测软骨细胞分泌NO的含量 NO是一种广泛存在于生物体内的小分子物质，是一种自由基，NO在体内代谢很快转变为NO2-和NO3-，而NO2-又将很快转变为NO3-，本法利用硝酸还原酶的特性将NO3-还原为NO2-来检测NO的含量。根据南京建成公司提供的硝酸还原酶检测试剂盒，通过测定550 nm处的吸光光度值，对各组细胞上清液中NO的含量进行检测。NO（μmol/L）=（测定管吸光度值-空白管吸光度值/标准管吸光度-空白管吸光度值）×标准品浓度（100 μmol/L）×样品测试前稀释倍数

1.3 统计学方法

采用统计软件SPSS 16.0对数据进行分析，正态分布计量资料以均数±标准差（x±s）表示，多组间比较采用方差分析（One-way ANOVA），两两比较采用LSD-t检验。以P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 流式细胞术检测软骨细胞凋亡情况

对照组软骨细胞凋亡率[（2.83±0.77）%]明显低于VEGF组[（9.28±2.35）%]和IL-1β组[（17.14±5.07）%]，三组差异有高度统计学意义（F = 56.145，P < 0.01）。进一步组间比较，VEGF组和IL-1β组分别与对照组比较，VEGF组与IL-1β组比较，差异均有高度统计学意义（P < 0.01），显示IL-1β与VEGF具有促进软骨细胞凋亡的作用，IL-1β促凋亡作用更明显。见图1。

2.2 软骨细胞PCNA蛋白的表达

对照组软骨细胞PCNA蛋白表达[（1.01±0.11）]明显高于VEGF组[（0.86±0.24）]及IL-1β组[（0.72±0.05）]，三组间差异有高度统计学意义（F=91.99，P < 0.01）。进一步组间比较，VEGF组与对照组比较，IL-1β组与对照组比较，差异均有高度统计学意义（P < 0.01），VEGF组与IL-1β组比较，差异无统计学意义（P > 0.05）。见图2。

2.3 NO含量的检测

软骨细胞上清液中NO含量VEGF组[（112.31±12.73）μmol/L]和IL-1β处理组[（150.02±15.34）μmol/L]明显高于对照组[（49.35±6.68）μmol/L]，差异有高度统计学意义（P < 0.01）。进一步组间比较，VEGF组与对照组比较，IL-1β组与对照组比较，VEGF组和IL-1β组比较，差异有高度统计学意义（P < 0.01）。

3 讨论

研究认为OA软骨退变与细胞因子、基质降解酶、细胞凋亡等密切相关。IL-1β被认为是介导关节软骨破坏最直接的细胞因子。IL-1β可以通过上调诱导型一氧化氮合酶和环氧化酶-2的表达，诱导NO和前列腺素E2的产生，而NO和前列腺素E2均是促进分解的重要因子。IL-1β能够刺激软骨细胞分泌基质金属蛋白酶（metalloproteinases，MMPs），加速软骨基质中蛋白聚糖和Ⅱ型胶原的降解，进而破坏软骨细胞外基质的完整性及组织的内稳态。本研究用IL-1β诱导软骨细胞以模拟OA软骨细胞病理学改变，结果显示，与对照组组比较，IL-1β能刺激软骨细胞，产生大量NO，IL-1β处理组软骨细胞凋亡率较正常组明显增高（P < 0.01），显示用IL-1β诱导的软骨细胞符合OA体外研究模型，能够模拟OA体外软骨细胞的病理学特点[1]。

VEGF是血管生成的重要介质，研究发现，血管发生参与了OA的发病机制，血管发生与OA滑膜炎、软骨丢失、软骨下骨重塑和骨赘形成密切相关。在众多影响血管发生的因子中VEGF的作用最为重要。关节软骨细胞表达VEGF数量增多，导致微小血管从软骨下骨向软骨不断长入。微小血管释放的促凋亡因子可以引起肥大层软骨细胞的凋亡。骨关节炎患者的关节软骨组织中促血管生成因子（如VEGF）的数量明显增加，而抗血管生成因子的数量明显减少，软骨组织血管生成因子和促血管生成因子的平衡被破坏，结果导致血管从软骨下骨长入到关节软骨中，在软骨内成骨中扮演重要角色，从而进一步加剧了骨关节炎的发展[2]。此外，VEGF在OA软骨组织中的表达明显增高[3]。OA患者的关节软骨组织表达VEGF的细胞数量明显多于健康对照组[4]。在OA模型中发现类似血管翳样组织，彩色多普勒发现OA关节软骨上的血管翳和组织学观察到的血管增生一致[5]。VEGF能够促进MMPs的分泌，减少基质金属蛋白酶组织抑制因子（tissue inhibitor of metalloproteinases，TIMPs）的产生，从而改变了MMPs/TIMPs的平衡，促进软骨基质降解[6-7]。Ludin等[8]发现膝关节腔注射VEGF能够引起关节软骨退变，导致OA的发生，认为VEGF是OA的重要致病因素。VEGF拮抗剂sFlt-1治疗骨关节炎组软骨细胞凋亡降低，软骨细胞增殖水平增加，提示VEGF能够介导膝关节骨关节炎软骨细胞凋亡，抑制软骨细胞增殖，VEGF对关节软骨细胞代谢的调节有重要作用[9]。VEGF参与了OA的病理改变过程，在其发病过程中发挥重要作用，以VEGF为靶点成为OA的治疗策略之一[10]。

细胞的凋亡，即程序性的死亡，对于细胞正常的生长和更新以及受损伤细胞的移除是十分重要的。正常软骨细胞凋亡发生率较低，骨关节炎关节软骨中有过度的软骨细胞凋亡，凋亡可发生于软骨全层，在OA模型中，可以观察到软骨细胞的凋亡较正常组明显增多[1，11]，而软骨细胞的凋亡是导致OA软骨细胞减少的主要原因。OA患者关节软骨细胞中有典型的细胞凋亡，而且细胞凋亡的数量与OA分级明显相关，软骨细胞的凋亡与OA的进展密切相关。软骨细胞凋亡的机制目前仍不完全清楚。研究发现NO是一种重要的诱导软骨细胞凋亡的因子，在OA的发病机制中起到非常重要的作用[12]。NO合成酶可以介导软骨细胞产生大量NO，NO能够导致软骨细胞凋亡的数量明显增加。OA软骨细胞凋亡数量与亚硝酸盐产生的水平、OA分级呈明显相关性。NO的产生能够诱导软骨细胞的凋亡，软骨细胞受到损伤后，抑制NO的产生可能阻止骨关节炎早期病程的进展，表明NO可诱发软骨细胞凋亡[13]。本研究结果显示，IL-1β处理组和VEGF处理组软骨细胞的凋亡率较正常组明显增高，显示IL-1β和VEGF对软骨细胞均有促凋亡作用，IL-1β的作用更强。同时发现VEGF和IL-1β干预的软骨细胞分泌的NO含量明显高于正常组，提示VEGF和IL-1β可能通过增加NO介导软骨细胞凋亡。

PCNA是一种分子量为36000，在细胞周期中参与DNA复制的蛋白质。它是DNA聚合酶的辅助因子，在S期参与DNA的复制，并作为细胞增殖状态的重要标志物。本研究结果发现VEGF组和IL-1β组中的PCNA蛋白表达量均低于正常组，说明VEGF和IL-1β有降低软骨细胞的增殖活性的作用。

综上述，本研究结果显示VEGF能够介导关节软骨细胞凋亡，抑制软骨细胞的增殖活性，VEGF可能通过增加NO介导软骨细胞凋亡。

[参考文献]

[1] 闫虎，苏友新，林学义.IL-1β诱导新西兰大白兔膝关节退变软骨细胞的体外培养及鉴定[J].中国中西医结合杂志，2014，34（1）：81-86.

[2] Carlevaro MF，Cermelli S，Cancedda R，et al. Vascular endothelial growth factor （VEGF） in cartilage neovascularization and chondrocyte differentiation：auto-paracrine role during endochondral bone formation [J]. J Cell Sci，2000， 113（1）：59-69.