擎天树初始外植体总酚含量与PPO活性的关系

戴 勤 ，俞建妹 ，谭 玲，黄松殿 ，杨 梅 ，梁小春

（1.广西大学 林学院，广西 南宁 530004；2.南宁市良凤江国家森林公园，广西 南宁 530031）

擎天树初始外植体总酚含量与PPO活性的关系

戴 勤1，俞建妹2，谭 玲1，黄松殿2，杨 梅1，梁小春2

（1.广西大学 林学院，广西 南宁 530004；2.南宁市良凤江国家森林公园，广西 南宁 530031）

以擎天树当年生嫩枝为材料，分析外植体在消毒及启动培养过程中总酚含量与PPO活性关系，为擎天树褐变机理研究、建立种质资源保存新途径提供参考依据。结果表明：（1）擎天树总酚含量与褐变呈正相关，培养基中添加PVP 2.0g/L及黑暗处理下褐变程度较弱，总酚含量低；不添加抗褐化剂处理褐变最严重，总酚含量最高；（2）外植体材料不同褐化程度下的PPO活性均很低，为0.15～0.3U之间，且不同抗褐化剂及黑暗与否等处理间无明显变化；（3）外植体总酚含量随培养时间增加呈先降后升趋势，各处理下PPO活性随培养时间增加趋于一致。

擎天树；组织培养；褐化；总酚；PPO 活性

在组织培养过程中，褐化是阻碍植株再生的重要因素之一，植物体内酚类物质被氧化成褐色的醌类物质，褐变产物对许多酶有抑制作用从而影响组培材料生长，严重时甚至导致死亡。组织培养中褐变程度与植物材料老化程度、基因型、培养条件等有密切关系，而木本植物褐化研究主要在基因型、植物年龄、采集季节、添加抗褐化剂等方面，其中以速生树种的研究较深入，并已解决了组培褐化的问题，如东门林场尾赤桉D2、D5、D6三个无性系中D5褐化率最低[1]，但仍有些无性系去除褐化存在困难。其他易褐化树种主要受基因型、培养条件影响较大，核桃组培褐化程度受取材季节、基因型影响较大[2]，桑树则可通过嫩枝在低盐培养基中，经低温、暗处里有效减轻褐变现象[3]。

擎天树树体高大，干形圆满通直，加工性能良好，是一种优良的工业用材树种[4]。由于擎天树分布区域较小，种子成苗率低，幼苗生长缓慢，群落结构散乱、混杂，受着强烈的人为干扰，以及对擎天树的过度利用，致使其成为珍稀濒危树种[5]，目前在群落结构、育苗技术、茎叶解剖、遗传多样性等方面开展了研究[6-8]，但对无性繁殖技术的研究较少。组培快繁技术具有增产效益显著的优势，可以快速扩大苗木产量、提高良种壮苗质量，为擎天树种质资源提供重要保障。本课题组对擎天树的组织培养已开展研究，解决了其外植体高污染率的问题，但发现其外植体极易褐化，而且短时间内褐化很严重，随着培养时间的推移褐化加剧，并且次氯酸钠可加速褐化过程[9]，成为制约擎天树外植体启动及增殖培养的阻碍因子。一些学者报道植物褐变与总酚含量及PPO活性之间有密切关系[10]，但擎天树外植体总酚含量及PPO酶活性是否与褐化有相关关系尚未见报道。本研究以擎天树茎段为试验材料，测定和分析擎天树外植体在消毒及启动培养阶段的总酚含量及PPO活性与褐变现象的关系，为进一步探讨擎天树外植体的褐变机理、优化消毒处理及培养基配方提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料

本试验外植体材料采于广西良凤江国家森林公园，分别采集长势优良的擎天树当年生枝条上带芽幼嫩茎段。采摘的种子放入样品袋中密封保存，带回实验室后用纱布包好放入冰箱4℃保存；茎段放入装有0.1%多菌灵溶液的塑料桶中保存，并盖上遮阴布防止样品失水。带回实验室后立刻进行预处理：将枝条修剪成带2～3个叶芽的短枝，叶柄保留3 mm左右，洗涤液浸泡10 min后用软毛刷刷净，用自来水充分冲洗2～3 h后作为试验材料。

1.2 试验设计

1.2.1 消毒处理

将预处理好的材料依次进行青霉素600万单位60 min、75%乙醇、升汞0.1%4 min消毒处理，分别对消毒前后的茎段外植体进行总酚含量及PPO活性的测定，消毒后的测定结果作为擎天树总酚含量及PPO活性的初始值。

1.2.2 黑暗处理

茎段消毒后接入1/2MS+6-BA0.4 mg/L+IBA0.3 mg/L+PVP2 g/L+琼脂5.5 g/L+糖30 g/L培养基中，分别进行黑暗及不遮光处理。与接种后第2天及第7天测定总酚含量及PPO活性。

1.2.3 培养时间对比

茎段外植体消毒后接入1/2MS+6-BA0.4 mg/L+ IBA0.3 mg/L+PVP2 g/L+琼脂5.5 g/L+糖30 g/L培养基中，采用暗处理。于接种后第2天、第4天及第7天测定总酚含量及PPO活性。

1.2.4 抗褐化剂处理

以1/2MS+6-BA0.4 mg/L +IBA0.3 mg/L +琼脂5.5 g/L+糖30 g/L为基本培养基，分别添加PVP2 g/L、AC0.5 g/L+VC0.2 mg/L、AC0.5 g/L+VC0.2 mg/L+PVP2 g/L的抗褐化剂，以不添加抗褐化剂作对照，均采用黑暗处理。于接种后第2天及第7天测定总酚含量及PPO活性。

1.3 测定方法

总酚含量测定采用福林酚显色法[11]，标准曲线回归方程为：y=25.311x+0.175，R2=0.9992。

多酚氧化酶（PPO）活性测定参照卢绪娟等[12]的研究方法，以每分钟每克样品吸光度值变化0.001为1个酶活力单位。

2 结果与分析

2.1 消毒对总酚含量及PPO活性的影响

为探究消毒对擎天树的总酚含量及PPO活性的影响，论证褐变与总酚含量与PPO活性的关系，试验分别对预处理后及消毒后的外植体茎段进行总酚含量及PPO活性测定。由图1、图2可知，材料消毒后的总酚含量为125.85 mg/g大于消毒前的114.21 mg/g，PPO活性则表现为是消毒前高出消毒后0.021 U，其活性高时总酚含量少，活性低时总酚含量升高，并且消毒环节使PPO活性降低，但二者前后对比差异均不显著。

图1 消毒前后外植体总酚含量Fig.1 Total phenolics contents before and after disinfection

2.2 黑暗处理对茎段外植体总酚含量的影响

图2 消毒前后外植体PPO活性Fig.2 PPO activities of before and after disinfection

培养过程中光照变化对材料褐变有影响，接种后进行必要的暗处理，能有效减弱褐化现象[13]。为进一步论证擎天树的总酚含量与褐变之间的关系，试验以茎段消毒后的总酚含量125.85 mg/g做初始值，分别测定黑暗及光照处理下的总酚含量，结果如图3所示。由于试验中材料褐化率较高，几乎所有材料均有不同程度的褐化，但两种处理下总酚含量差异显著，第2天、第7天材料总酚含量均下降，光照处理下渗出培养基的褐色物质直径约为1.0 cm，黑暗处理下渗出培养基的褐色物质直径约为0.8 cm，黑暗处理下总酚含量与光照处理对比分别下降18.98 mg/g及17.04 mg/g，第7天时两个处理较第2天总酚含量稍有升高。光照处理下的总酚含量较黑暗处理下的高，说明总酚含量高，褐变严重，黑暗处理能缓解擎天树外植体褐化。

图3 黑暗及光照处理下外植体总酚含量Fig.3 Total phenolics contents of explants treated with dark and light treatment

2.3 培养时间对茎段外植体总酚含量的影响

如图4所示，培养时间对总酚含量的影响极显著。材料在培养第2天时总酚含量降低至94.84 mg/g，并在培养的第4天降到最低为80.28 mg/g，而后总酚含量有所增加。擎天树在短时间内会迅速呈现较严重的褐变，总酚参与了褐变的过程，故接种后第二天的总酚含量相比第一天有所下降，并在一定时间内随时间的延长而不断降低。

图4 不同培养时间下外植体总酚含量Fig.4 Total phenolics contents of explants treated with different culture time

2.4 抗褐化剂对茎段外植体总酚含量的影响

外植体消毒后测定的总酚含量作为原始值，与第2天和第7天的总酚含量进行方差分析及多重比较。从表5可以看出，在培养的第2天，所有处理总酚含量均值较原始值有所降低，其中以添加 PVP2.0 g/L +VC0.2 mg/L+AC0.5 g/L的处理下降最多，总酚含量仅为89.39 mg/g，培养基上褐变斑块最小直径约0.6 cm；培养第7天时，总酚含量较第2天高，添加有PVP物质的两个处理与其他处理差异显著，第7天时添加 PVP2.0 g/L处理下总酚含量为100.06 mg/g，褐变斑块直径约0.6 cm添加PVP2.0 g/L+VC0.2 mg/L+AC0.5 g/L的处理总分含量为112.10 mg/g，褐变斑块最小直径约0.7cm，未添加任何抗褐化剂的处理总酚含量最高，为121.72 mg/g，认为培养基添加PVP2.0 g/L的抗褐化效果较好。

图5 不同抗褐化处理下外植体总酚含量Fig.5 Total phenolics contents of explants treated with different kinds of anti-browning agents

2.5 不同培养时间下光照及不同抗褐化剂处理对茎段外植体PPO活性的影响

消毒后对上述黑暗处理、不同时间对比、抗褐化剂处理的外植体材料进行PPO活性测定，结果见图6，擎天树PPO活性不大，第2天时，添加PVP2.0 g/L光照处理的PPO活性最大为0.301 U，暗处里PPO活性菌比其低，而未添加抗褐化剂及PVP2.0 g/L处理PPO活性比第一天还低，最小为0.160 U，在培养第7天各处理PPO活性趋于一致，活性最大的处理与活性最小处理差值仅有0.036 U。多种不同处理下的PPO活性对比说明酶活性的高低不能作为判断擎天树外植体褐变情况的主要依据，罗晓芳等对阿月浑子多酚氧化酶活性研究也发现，褐变严重的阿月浑子多酚氧化酶活性很低[14]。

图6 不同处理方式下外植体PPO活性Fig.6 PPO activities of explants treated with different kinds of treatment methods

3 讨 论

酚类物质是植物体内一种次生代谢产物，在酶的作用下氧化从而引起颜色的改变[15-17]，是褐化发生的物质基础，多酚氧化酶包括多种酶，且具有专一性，常被认为与植物褐化现象有密切关系，适宜的抗褐化可有效防止外植体褐变，根据其作用原理不同一般分为还原型如VC，在酶催化作用时消耗溶解氧，使得酚类物质不被氧化，以及吸附型如PVP、活性炭以物理性吸附酚类为主。木本植物褐化现象较普遍，如华盖木极易褐化，在接种后PPO活性快速增加，随后活性又大幅度下降之后下降速度减缓，其总酚含量与PPO趋势相似但时间滞后[18]；郑超等研究曼地亚红豆杉时认为愈伤组织褐化程度与总酚含量呈显著正相关,而总酚含量与PPO、POD活性则呈负相关[19]；红花玉兰研究中认为低温遮光处理后转入25℃的全光照下培养可以有效抑制其褐化[20]。有研究发现擎天树分泌细胞普遍存在于各薄壁细胞群中，分泌系统发达[7]；梁机等提出擎天树种子含有抑制种子萌发、生长的成分[21]，但是其分泌物成分、含量并未有相关报道，其是否与擎天树强烈的褐化现象有关仍有待研究。

本试验测定了不同处理下擎天树组织培养过程总酚含量、PPO活性，材料消毒环节对总酚含量、PPO活性影响不显著，接种后期总酚含量与擎天树的褐变有很大关系，暗处里对控制材料褐化效果较好，可能是因为擎天树体内酶系统具有光活性，在光照条件下加速酚类物质的氧化从而能促进褐变。外植体总酚含量随培养时间增加呈先降后升趋势，与吴银凤研究牡丹的红衣教主品系结果一致[15]，认为其有一个下降的过程是因为外植体中的酚类物质参与了酶促褐变反应。光照和不同抗褐化剂处理下PPO活性变化很小，仅在第2天相差较多，而在第7天时活性与第一天相近，结果表明培养基中添加2.0 g/L的PVP可以减缓茎段外植体的褐化情况，但是效果仍不理想，可以考虑在PVP溶液中对外植体进行切割再接种。擎天树的总酚含量高，但PPO活性低，褐变严重，可能的原因是擎天树中所含的次生代谢物除酚类物质外还有单宁或者类黄酮物质，多酚氧化酶不是其酚类物质的专一性氧化酶，褐变是由另一种酶引起的。因此擎天树外植体中含有哪些酚类物质、次生代谢物种类，褐变主要是由哪种物质氧化引起等问题还需要进一步探索，从而为寻找解决擎天树外植体褐变现象的途径、为实现外植体启动及增殖培养提供正常的繁殖材料。

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Relationship total phenolics contents and polyphenol oxidase activities in explant of preliminary culture in Vitro of Parashorea chinensis

DAI Qin1, YU Jian-mei2, TAN Lin1, HUANG Song-dian2, YANG Mei1, LIANG Xiao-chun2
(1.Forestry College of Guangxi University, Nanning 530004, Guangxi, China;2. National Forest Park of Liangfengjiang, Nanning 530031, Guangxi, China)

Using shoots fromParashorea chinensisexplants, the regulation of total phenolics contents and polyphenol oxidase activities were studied in the processes of the disinfection and primary culture, which would provide the new references for the browning mechanism and establishment of germplasm conservation. The results were as follows: (1) There was a positive correlation between the total phenolics content and the browning, the browning levels were weaker with both treatments of adding PVP 2.0 g/L into medium and by dark treatment, the total phenolics were lower in the tested explants; while the total phenolics content went up to the top if without any anti-browning agents. (2) The polyphenol oxidase activities were low between 0.15～0.3U and the treatments with different dose of ppo and dark and non-dark, the browning levels had insignif i cant changest. (3) The total phenolics contents showed a fi rst decreased and then increased trend in 2 days, the changing trends of polyphenol oxidase activities tended to converge with the cultural time after induction. The relation between the total phenolics content and the polyphenol oxidase was not obvious.

Parashorea chinensis; tissue culture; browning; total phenolics; polyphenol oxidase activity

S792.99

A

1673-923X(2014)04-0050-04

2013-07-10

广西林业厅科技项目（桂林科字201019）；国家高等学校特色专业建设项目（TS1Z097l）

戴 勤（1988-），女，壮族，广西宜州人，硕士研究生，主要从事植物生理生态方面研究；E-mail：jenny150@163.com

杨 梅（1970-），女，吉林长春人，从事人工林培育方面的研究工作

[本文编校：吴 彬]