桐油主要脂肪酸定量分析方法的构建及其应用

贺舍予 ，钟海雁 ，金超 ，周波

（中南林业科技大学a.经济林育种与栽培国家林业局重点实验室；b.食品科学与工程学院，湖南 长沙 410004）

桐油主要脂肪酸定量分析方法的构建及其应用

贺舍予a,b，钟海雁a,b，金超b，周波b

（中南林业科技大学a.经济林育种与栽培国家林业局重点实验室；b.食品科学与工程学院，湖南 长沙 410004）

以十五烷酸甲酯为内标物，建立了通过气相色谱仪定量分析桐油中6种脂肪酸含量的方法，并利用所建立的方法对湖北金丝、景阳桐油的脂肪酸组成进行分析。结果表明：各脂肪酸甲酯工作曲线线性相关性R2在0.979以上，回收率为98.9%～104.5%，RSD值为4.6%～7.3%；2种品种桐油中都含有棕榈酸、硬脂酸、油酸、亚油酸、亚麻酸、α-桐酸，其中金丝桐油中含量分别为0.018 、0.019、0.071、0.069 、0.003、0.729 g/g，景阳桐油中含量分别为0.021、0.022、0.054、0.070、0.002、0.585 g/g，金丝桐油中α-桐酸含量高于景阳桐油。

桐油；品种；脂肪酸；定量分析

油桐属于大戟科Euphorbiaceae油桐属Vernicia植物，是著名的工业油料树种[1-2]，油桐籽经机械压榨或溶剂浸提工艺便可获得桐油。α-桐酸是桐油脂肪酸的主要组成部分[3-4]，其结构中的π-π共轭双键使其易给出电子发生亲电加成反应，从而形成一系列结构和功能各异的聚合物单体，因此桐油在高分子材料合成方面具有广泛的应用[5-6]；另外α-桐酸还可通过氧化聚合形成一层致密的油膜，该油膜具有附着力强、光泽性好、抗腐蚀、防渗透、绝缘性好等特点，因此桐油在新型油墨、新型油漆方面也具有广泛的应用[7-8]，桐油中α-桐酸的含量对桐油的品质具有决定性的作用。因此，桐油中脂肪酸的分析检测对桐油的品质评价具有重要的意义。

桐油中脂肪酸的分析检测方法一般采用紫外分光光度法和气相色谱分析法。紫外分光光度法通过标准品建立工作曲线来分析各脂肪酸的含量，该方法对于不饱和度相同的脂肪酸特异性不强，另外油中的不皂化物会对检测结果有一定的影响；气相色谱仪因其高效的分离效能和灵敏的检测限使其成为脂肪酸分析的常用仪器[9-10]。阳艳等[11]通过气相色谱分析桐油的脂肪酸组成以此来判断桐油的品质特性，但只是利用面积归一对脂肪酸进行半定量；陈陶静等[12-13]运用气质联用(GC-MS)分析不同产地不同季节桐油的脂肪酸组成；王发松等[14]利用GC-MS分析了金丝桐油中的脂肪酸组成，在桐油中还发现桐酸存在5种同分异构体。

本研究利用气相色谱仪，以十五烷酸为内标物，建立了桐油中棕榈酸、硬脂酸、油酸、亚油酸、亚麻酸、α-桐酸的定量分析方法，利用所建立的方法定量分析了金丝桐油和景阳桐油的脂肪酸组成，并从α-桐酸含量的角度评价了这2种桐油的品质。

1 材料和方法

1.1 材料与仪器

（1）脂肪酸甲酯标准品：α-桐酸甲酯（Cayman美国）、十五烷酸甲酯、棕榈酸甲酯、硬脂酸甲酯、油酸甲酯、亚油酸甲酯、亚麻酸甲酯（Sigma 美国）。

（2）试剂：正庚烷，色谱纯（国药集团化学试剂有限公司）；甲醇，色谱纯（美国Tedia公司）；无水硫酸钠，分析纯（国药集团化学试剂有限公司）；氢氧化钾，分析纯（天津大茂化学试剂厂）；石油醚，分析纯（国药集团化学试剂有限公司）。

（3） 仪 器（ 设 备）：OHAUS CP224C电 子 天 平（0.0001 g）（ 美 国 OHAUS）、SHIMADZUGC 2014气相色谱仪（日本岛津公司）、FOSS索氏浸提系统（ST310，丹麦）、粉碎研磨机（IKAA10,德国IKA）。

（4）材料：桐油样1由金丝油桐种子制得，种子由湖北林科院提供；桐油样2由景阳油桐种子制得，种子由湖北林科院提供。

1.2 桐油的制取

将油桐种子阴干后去壳，取35 g种仁用粉碎研磨机研磨粉碎30s，收集粉末于两端塞有脱脂棉的滤纸筒中，用滤纸筒装取5 g粉末，捆紧后，置于索氏浸提装置中，将石油醚加入抽滤筒中后，运行程序提取油脂，并计算桐籽出仁率和含油率；提油程序运行完成后，收集桐油于冰箱中保存备用。

1.3 脂肪酸定量分析方法的建立

以正庚烷为溶剂将各脂肪酸甲酯标准品配制成0.1 mg/mL的溶液，分别取1.0uL进GC分析，以确定各脂肪酸甲酯的保留时间；再取1.00mL各脂肪酸甲酯标样溶液进行混合，取该混合液1.0uL进气相分析。通过比对单一标样色谱图和混合标样色谱图确定各脂肪酸甲酯标样的保留时间，以保留时间对样品峰进行定性分析。配制质量浓度范围为2.000～20.00mg/L的各脂肪酸甲酯混标溶液，1.0uL进样。以峰面积对浓度绘制标准曲线，各脂肪酸相对于内标物的相对响应因子（Relative Response Factor，RRF）如式（2），依据式（3）对脂肪酸进行定量[15]。

式中：area(X)代表某种脂肪酸的峰面积；[X]代表某种脂肪酸的浓度；area(I)代表内标物的峰面积；[I]代表内标物的浓度。

通过加入1 mL某种已知浓度的脂肪酸甲酯标准品来测定加标回收率。用实测值与供试品中含有量之差，除以加入对照品量来计算回收率。依据式（4）对回收率进行计算。在加样回收试验中须注意对照品的加入量与供试品中被测成分含量之和必须在标准曲线线性范围之内；加入的对照品的量要适当，过小则引起较大的相对误差，过大则干扰成分相对减少，真实性差。

式中：R为回收率；M1为实测值；M2为供试品所含被测成分量；M3为加入对照品量。

1.4 桐油脂肪酸甲酯的制备

桐油脂肪酸的甲酯化参考ISO 5509-2000[16]进行预处理，取0.0100g油样（要准确称量）于圆底烧瓶中，加入1 mL 1 M KOH-甲醇溶液，之后于75℃条件下水浴加热,冷凝回流10min后，冷却至室温后加入1 mL的C15∶0；转移内容物至250mL分液漏斗中，加正庚烷20mL，加水20mL，摇动待溶液分层后分液，收集酯层；并对水层再萃取1次后与第1次酯层合并，所得溶液用水洗涤至废水呈中性为止。分离出酯层，用无水硫酸钠干燥后，过滤，定容至100.00mL酯的正庚烷溶液。经过甲酯化处理后，此时桐油脂肪酸甲酯浓度为0.1 mg/mL，以备分析用。

1.5 数据分析

用 IBM SPSS statistics 19.0对数据进行分析，所有的数据进行3次重复。

2 结果与分析

2.1 油桐桐籽含油率差异

桐籽为油桐树的果实，包含果皮和种籽。油桐树果实内部的桐籽含有丰富的油脂，其提取物便是桐油。桐籽出仁率和含油率结果见表1。由表1可知，金丝油桐桐籽出仁率为57.97%，含油率为59.94%；景阳油桐桐籽出仁率为56.66%，含油率为56.29%；桐籽出仁率差值为1.31%，含油率差值达到3.65%。从桐籽的出仁率以及含油率的高低来看，金丝油桐籽桐油产量高于景阳油桐籽，表明不同油桐品种之间种籽含油率差异明显。其品种不同是油桐树种籽的含油率有差别的主要原因。选择不同品种的油桐树时，以含油率为重要指标具有必要性[17]。

2.2 脂肪酸甲酯标准品保留时间的确定

在该色谱程序升温条件下脂肪酸甲酯混标气

品种出仁率/%含油率/%金丝油桐57.9759.94景阳油桐56.6656.29相色谱如图1所示。脂肪酸所含碳原子越多，则出峰越慢；混标色谱图出峰顺序依次为十五烷酸甲酯、棕榈酸甲酯、硬脂酸甲酯、油酸甲酯、亚油酸甲酯、亚麻酸甲酯、α-桐酸甲酯。各脂肪酸甲酯可被较好分离，且相邻各脂肪酸甲酯保留时间间隔较大，均在1 min以上。若样品峰保留时间与标准品峰保留时间相比，时间差小于0.1 min，则定性为同一种脂肪酸[18]。本方法分析时间为1 h左右，采用了二阶梯升温法分离程序，初始温度较低，通过第一级快速升温，可分离开碳原子数量有差异的脂肪酸甲酯，通过第二级缓慢升温，可以分离出碳原子数量相同结构不同的脂肪酸甲酯，从而使各脂肪酸甲酯，特别是α-桐酸得到完全分离。

GC(Shimadzu-2014)配备f l ame ionization detection，FID检测器（Shimadzu instruments Manufacturing, Co., Ltd. Suzhou China）；脂肪酸的分离通过SP2340石英毛细管柱来实现。以氮气作载气，进样口温度为250℃，检测器温度为300℃，不分流进样；初始柱温50℃，保持2 min，然后以20.00℃/min升温至170℃，保持5 min，继而以2.00℃/min升温至180℃，保持10min，最后以4.00℃/min升温至220℃，保持22 min，进样量1 uL。

2.3 各脂肪酸甲酯标准品的线性方程、RRF、精密度、回收率

在所配制浓度范围内，各脂肪酸甲酯标准品的线性方程、RRF、DL、QL、线性范围见表2。在所选取浓度范围内工作曲线的R2＞0.979，说明在该浓度范围内峰面积与浓度线性相关性较好。各脂肪酸甲酯的DL（S/N≥3）在 0.103 5～ 0.136 5 mg/kg之间，QL（S/N≥10）在0.345 1～0.455 1 mg/kg之间，适合痕量分析的要求。

桐油中各脂肪酸含量检测精密度（RSD）结果如表2所示。桐油中α-桐酸RSD值为7.3%，棕榈酸、硬脂酸、油酸、亚油酸、亚麻酸RSD值都在5.6%以内，都能满足精确测量的要求。数据重复性好、精密度高，表明该方法测定桐油脂肪酸的稳定性好。

桐油中各脂肪酸甲酯加标回收率结果如表2所示。桐油中α-桐酸甲酯回收率为101.9%，其他脂肪酸甲酯回收率在98.9%～104.5%之间，表明此方法准确度高，可有效测定桐油中各脂肪酸。

表2 各脂肪酸甲酯标准品线性回归方程（2.000～20.00mg/L）、线性相关性、相对响应因子、最低检测线、最高检测线、线性范围、精密度、回收率†Table 2Fatty acid methylesters standard linear regression equations (2.000～20.00mg/L), R2, RRF, DL, QL, Linear ranges,RSD, Recovery

2.4 桐油的脂肪酸组成

景阳和金丝桐油经甲酯化处理后其气相色谱如图2所示，与脂肪酸甲酯混标色谱图比对发现桐油含有棕榈酸、硬脂酸、油酸、亚油酸、亚麻酸和α-桐酸。所制取桐油经过定量分析，其结果见表3。表3表明，在景阳桐油中各脂肪酸的含量分别为0.021、0.022、0.054、0.070、0.002、0.585 g/g；在金丝桐油中各脂肪酸的含量分别为0.018、0.019、0.071、0.069、0.003、0.729 g/g。通过对金丝桐油和景阳桐油的α-桐酸的检测结果进行单因素方差分析，发现两者之间有显著差异（p＜0.05）。

图2 脂肪酸甲酯气相色谱Fig.2Fatty acid methylesters by gas chromatography FIG

表3 不同品种桐油中脂肪酸的组成†Table 3Fatty acid composition of Chinese tung oil in different cultivars g/g

经比较桐油中α-桐酸含量发现金丝油桐比景阳油桐所制取桐油α-桐酸含量高，这可能是由于不同品种油桐中桐酸合成酶基因（fadx）表达差异引起的。桐酸合成酶基因是控制亚油酸转化为桐酸的关键基因，其先在细胞核内通过转录生成mRNA，然后在细胞质中核糖体和tRNA协作下合成桐酸合成酶，并通过使亚油酸脱氢获得桐酸[19-20]。因此，促进桐酸合成酶基因的表达，可有效增加α-桐酸的积累，提高桐油中α-桐酸的含量，是油桐分子育种的重要内容。此外，油桐树的实地生长环境及桐籽采收时节与保藏环境的差异也可能对桐油品质产生影响。

从表3中还可以看出金丝桐油脂肪酸总含量为0.909 g/g，景阳桐油脂肪酸总含量为0.754 g/g，说明景阳桐油中不皂化物比金丝桐油含量高，其不皂化物可能是高级脂肪醇、甾醇和碳氢化合物等，其种类有待于进一步研究。此外，本研究发现桐油在储存过程中伴随发生的桐酸异构化，即使在低温密封条件下也发生，关于抑制桐油变质的问题有待于进一步研究，探索出适合于桐油保藏的条件，对于桐油的品质保持具有重要意义。

3 小结

本研究运用内标法，以十五烷酸甲酯为内标物，建立了通过气相色谱仪定量分析桐油中6种脂肪酸含量的方法；各脂肪酸甲酯工作曲线线性相关性R2在0.979以上，回收率为98.9%～104.5%，RSD值为4.6%～7.3%；该方法具有实用性，能有效分离测定桐油中各脂肪酸，特别是对α-桐酸的含量进行定量分析，可从桐油脂肪酸含量的角度对桐油品质的优劣进行评价。

研究分析了金丝桐油和景阳桐油中6种脂肪酸的真实含量，其中α-桐酸含量分别为0.072 9、0.058 5 g/g，其含油率分别为59.94%、56.29%。金丝油桐原产于湖北省恩施州来凤县，所榨桐油色泽金黄，可牵拉成丝，故有“金丝桐油”之美称；景阳油桐原产于湖北省郧西县景阳乡，1983年经中国科学院专家鉴定为国家优质植物品种。但从桐油中α-桐酸含量多少来看，金丝桐油质量优于景阳桐油。

[1]谭晓风. 油桐的生产现状及其发展建议[J]. 经济林研究,2006, 24(3): 62-64.

[2]张玲玲, 彭俊华. 油桐资源价值及其开发利用前景[J]. 经济林研究, 2011, 29(2): 130-136.

[3]付梅轩, 陈 燕. 我国主要产区的桐油脂肪酸组成[J]. 中国油脂, 1985, (1): 2-8.

[4]付梅轩, 陈 燕. 桐油中桐酸的含量测定方法[J]. 中国油脂,1985, (1): 17-21.

[5]黄 坤, 夏建陵. 桐油及其衍生物的改性在高分子材料中的应用进展[J]. 化工进展, 2008, 27(10): 1588-1592.

[6]余鼎声, 张 骏, 吴 芮, 等. 桐油/豆油与苯乙烯共聚合研究[J]. 高分子材料科学与工程, 2006, 22(4): 88-90, 94.

[7]魏绣枝, 王 颖. 桐油资源的深度开发与利用[J]. 广西林业科学, 1994, 23(2): 105-106.

[8]李世中. 桐油综合开发应用前景广阔[J]. 经济林研究, 1997,15(4): 71-72

[9]袁德义, 彭邵峰, 邹 峰. 油茶种子脂肪酸与游离氨基酸的分析[J]. 中南林业科技大学学报, 2011, 31(1): 77-79.

[10]王 渊, 谭晓风, 谢 鹏. 油茶优良无性系的理化性质及脂肪酸的分析[J]. 中南林业科技大学学报, 2011, 31(6): 70-74.

[11]阳 艳, 张 敏. 湘西桐油中脂肪酸分析方法的研究[J]. 中国林副特产, 2007, (4): 5-7.

[12]陈陶静, 赵景婵, 蓝春波, 等. 陕南桐油中脂肪酸组成的气质联用分析[J]. 中国林副特产, 2012, (6): 13-15.

[13]傅伟昌, 顾小红, 陶冠军, 等. 桐油脂肪酸组成分析和甘三酯结构判定[J]. 天然产物研究与开发, 2008,20(6):964-968, 982.

[14]王发松, 尹智亮, 谭志伟, 等. 来凤金丝桐油的化学组成研究[J]. 湖北民族学院学报, 2008, 26(3): 291-293.

[15]朱勇. 茶油的脂肪酸变化及其生物酚的抗氧作用[D]. 长沙：中南林业科技大学, 2013: 9.

[16]ISO 5509-2000Animal and vegetable fats and oils – Preparation of methyl esters of fatty acids[S]. ISO copyright off i ce, 2000.

[17]王 森, 谢碧霞, 何 方. 秦岭山区漆树种籽含油率与脂肪酸成分分析[J]. 中南林业科技大学学报, 2011, 31(3): 97-101.

[18]孙汉洲, 黄丽群, 李志辉. 赤桉树叶脂肪酸的定量分析[J]. 中南林学院学报, 2005, 25(6): 104-105.

[19]汪阳东, 李 元, 李 鹏. 油桐桐酸合成酶基因克隆和植物表达载体构建[J]. 浙江林业科技, 2007, 27(2): 291-293.

[20]李 元. 油桐桐酸合成酶基因(fadx)的克隆、反义表达载体的构建及对烟草的初步转化[D]. 呼和浩特:内蒙古农业大学,2007: 9-12.

Study and application of quantitative analysis of fatty acid of tung oil

HE She-yua,b, ZHONG Hai-yana,b, JIN Chaob, ZHOU Bob
(a. Key Lab. of Non-wood Forest Products of State Forestry Administration, Changsha 410004, Hunan, China;b. School of Food Science and Engineering, Central South University of Forestry & Technology, Changsha 410004, Hunan, China)

The quantitative analysis methods of fatty acids, i.e. C16:0, C18, C18:1-9c, C18:2-9c12c, C18:3-9c12c15c, C18:3-9z11e13e in Chinese tung oils were developed by gas chromatography using methyl pentadecanoate as the internal standard. Then, two Chinese tung oils from Jingyang and Jinsi cultivars were analyzed by the methods. The results show that the correlation coeff i cients (R2) of all the linear regression equations of fatty acid methyl esters (FAMEs) of above fatty acid standards were higher than 0.979; the recoveries were from 98.9% to 104.5%, the RSDs were from 4.6% to 7.3%; the fatty acid contents of Jingyang and Jinsi tung oils were 0.021,0.022, 0.054, 0.070, 0.002, 0.585 g/g and 0.018, 0.019g, 0.071, 0.069, 0.003, 0.729 g/g of C16:0, C18, C18:1-9c, C18:2-9c12c, C18:3-9c12c15c, C18:3-9z11e13e, respectively, measured with the method, the content of C18:3-9z11e13e of Jinsi tung oil was higher than that of Jingyang tung oil, which means that Jinsi tung oil has a better quality.

Chinese tung oil; cultivar; fatty acid; quantitative analysis

S789；S794.3

A

1673-923X(2014)05-0083-05

2013-06-18

林业公益性行业科研专项（201304707）

贺舍予（1990-），男，湖南望城人，硕士研究生，主要从事木本粮油加工与利用方面的研究；

E-mail：hesheyu2012@126.com

钟海雁（1963-），男，浙江浦江人，教授，博士，博士生导师，主要从事经济林产品加工方面的研究；

E-mail：zhonghaiyan631210@126.com

[本文编校：谢荣秀]