当归愈伤组织培养研究

蔡子平 ，王国祥 ，王宏霞

（1.甘肃省农业科学院中药材研究所，甘肃 兰州 730070；2.甘肃农业大学农学院，甘肃 兰州730070；3.甘肃省中药材种质改良与质量控制工程实验室，甘肃 兰州 730070）

当归［Angelica sinensis（Oliv.）Diels］为伞形科多年生草本植物，以干燥根入药，具有补血活血、调经止痛、润肠通便等功效，素有“十方九归”之称［1］。其主产于甘肃、云南、四川、陕西、青海等省，尤以甘肃岷县当归为最佳［2］。近年来，随着中药产业的发展，当归已在美容保健、饮品、调味品等行业中广泛应用，市场需求量也越来越大，种植当归已成为甘肃当归主产区的支柱产业之一［3］。

当归是一种适宜高海拔育苗、低海拔引种移栽的特殊植物。长期以来，利用传统开垦生地育苗的方法，既破坏天然植被，造成严重的水土流失，导致环境恶化，又因当归种子的生产周期长，繁殖系数低，育苗成本高。加之近年来由于气温升高，原适宜区的适宜性下降，其育苗所需的高海拔荒地也越来越少，优质当归种苗已成为限制当归生产的瓶颈［4］。目前，生产中由于品种混杂严重，种苗质量良莠不齐，导致早期抽苔现象严重，影响到当归的产量和品质。随着生物技术的发展，组织培养技术在作物品种改良方面发挥了突出的作用，也为解决当归种子、种苗质量提供了一条新途径［5～8］。

1 材料与方法

1.1 材料

当归无菌苗培养材料为甘肃岷县茶埠乡当年采集的新鲜种子，分去翅和不去翅两种。

1.2 方法

1.2.1 种子预处理 先将作为培养材料的去翅和不去翅的当归种子用自来水冲洗1遍，再加入洗涤剂清洗，然后用自来水冲洗干净，在超净工作台上用75%乙醇浸泡10 s，用无菌水冲洗2～3遍，再用1 g/kg的升汞溶液浸泡6 min，最后用无菌水冲洗3～4次备用。

1.2.2 无菌苗培养 在无菌条件下，将经消毒处理的两种当归种子分别接种于MS、1/2MS和自制琼脂培养基（琼脂与水比例为1∶200）3种培养基中培养。每处理20瓶，每瓶4粒。每天进行观察，20 d后统计种子发芽率及污染率。

1.2.3 愈伤组织诱导及外植体筛选 种子培养20 d，待苗长到真叶抽出后，分别以子叶、真叶、叶柄及根为外植体，在无菌条件下，分别将子叶、真叶、叶柄及根切成0.5～1.0 cm的小块，接种于H+0.5 mg/L 2，4-D培养基中进行愈伤组织诱导，筛选最佳外植体。每处理24瓶，每瓶3块。每天观察生长情况，20 d后统计诱导率。

1.2.4 初代培养 将筛选出的最佳外植体转接到以H、MS和1/2MS为基本培养基，并添加0.5 mg/L 2，4-D的培养基上进行愈伤组织诱导。每处理16瓶，每瓶3块。每天观察生长情况，20 d后统计诱导率。

1.2.5 继代培养 15 d后将初代培养诱导出的愈伤组织再切成小块，转接到以H为基本培养基，分别添加0.5、1.0、2.0 mg/L 2，4-D和0、0.5、1.0 mg/L IAA的继代培养基中培养，以便获得更多的愈伤组织。每处理16瓶，每瓶3块。每天观察统计生长情况。

1.3 培养条件

培养室温度为（25±2）℃，光照强度为1 500～1 800 Lx，光照 12 h/d。

1.4 统计分析方法

有关的试验数据均采用DPS和Excel软件进行统计分析。

2 结果与分析

2.1 不同培养基对无菌苗培养的影响

从表1可以看出，去翅种子和不去翅种子的发芽率均以自制琼脂培养基中最高，分别为79.0%和87.5%，但其污染率也分别达到最高值76.3%和85.0%；其次是在1/2 MS培养基中，发芽率分别为55.4%和68.6%，且污染率均最低，分别为6.5%和11.6%；在MS培养基中的发芽率相对较低，分别为29.1%和40.5%，但污染率均较高，分别为13.2%和14.3%。可见，在同一培养基中，不去翅种子的发芽率明显高于去翅种子，但其污染率也相应较高。综合来看，当归无菌苗培养时，以去翅种子在1/2 MS培养基中的培养效果最好。

表1 不同培养基中当归种子的发芽率及污染率

2.2 不同外植体对愈伤组织诱导的影响

观察结果表明，接种5 d后，子叶、叶柄的边缘均开始膨胀。随着培养时间的延长，叶柄的周围开始出现大量颗粒状、白色愈伤组织，且生长旺盛；子叶膨大明显，在其周围伤口处出现少量颗粒状愈伤组织，但容易褐化；叶片膨大不明显，伤口处慢慢褐化，直至最后叶片全部黄化；根基本没有变化。从表2可以看出，叶柄的诱导率最高，达91.32%，且愈伤组织生长旺盛，色泽亮；子叶诱导率虽在80%以上，但容易老化、褐变；叶片的诱导率仅为18.06%。因此，当归愈伤组织诱导时，以叶柄作为外植体最适宜。

表2 不同外植体的愈伤组织诱导率

2.3 不同培养基对叶柄愈伤组织诱导的影响

从表3可以看出，各处理均能较好的对叶柄诱导出愈伤组织，其中以H+0.5 mg/L 2，4-D培养基的诱导率最高，达89.58%±13.01%，且愈伤组织数量多，颜色淡黄，生长旺盛；MS+0.5 mg/L 2，4-D培养基虽能诱导出愈伤组织，但愈伤组织极褐化严重；1/2 MS+0.5 mg/L 2，4-D培养基的诱导率相对较低，诱导效果次于H+0.5 mg/L 2，4-D培养基。即H培养基为当归诱导愈伤组织的适宜基本培养基，H+0.5mg/L 2，4-D的诱导效果较好。

表4 继代培养诱导效果

表3 不同培养基对叶柄愈伤组织的诱导效果

2.4 植物生长调节剂对继代培养的影响

由表4可以看出，在H培养基中仅添加2，4-D时，随着2，4-D浓度的增加，出愈率逐渐降低，愈伤组织均无增殖现象；2，4-D浓度为0.5 mg/L时出愈率最高，达97.92%；2，4-D浓度为2.0 mg/L时诱导出的愈伤组织极容易褐化。同时添加2，4-D和IAA时，在IAA浓度为0.5 mg/L条件下，随着2，4-D浓度的增加，出愈率逐渐降低，以2，4-D浓度为0.5、1.0 mg/L时的愈伤组织均增殖明显，生长旺盛；在IAA浓度为1.0 mg/L条件下，随着2，4-D浓度的增加，出愈率呈先增加再降低趋势，以2，4-D浓度为0.5 mg/L时的愈伤组织均增殖明显，生长旺盛。由此可见，只有低浓度的2，4-D配合较高浓度的IAA才可产生大量的颗粒状愈伤组织，而高浓度的2，4-D对愈伤组织的增殖有抑制作用。以H+0.5 mg/L 2，4-D诱导愈伤组织效果最好，出愈率达90%以上；以H+0.5 mg/L 2，4-D+1.0 mg/LIAA增殖效果最好。

3 小结与讨论

1）试验结果表明，种子去翅后在1/2 MS培养基上培养是获得当归无菌苗的最佳条件，此时发芽率达55.4%，污染率仅为6.5%。叶柄为当归愈伤组织诱导的最佳外植体，H培养基为当归诱导愈伤组织的适宜基本培养基。诱导愈伤组织培养基为H+0.5 mg/L 2，4-D时，出愈率达90%以上；继代增殖培养基为H+0.5 mg/L 2，4-D+1.0 mg/L IAA的增殖效果较好。

2）当归种子去翅后灭菌更彻底，可极大地降低污染率。选择无菌苗培养基时，在水+琼脂培养基上当归种子萌发率较高，但污染率也很高，其原因有待于进一步研究。组织培养中通常以茎尖或茎段作为外植体进行愈伤组织的诱导，但从当归愈伤组织诱导结果来看，叶柄是最好的诱导材料，这与张俊莲的结论相似，且材料易得，培养效率也较高［9］。实验中发现，当归愈伤组织在培养过程中极易出现褐化，可能与选用的激素及培养的时间有关，所以在后续的研究中应继续优化激素配比，在继代增殖的过程中要勤转接，尽量减少在同一瓶培养基中的培养时间。

［1］ 国家药典编委会.中华人民共和国药典（2010版一部）［M］.中国医药科技出版社，2010：124-125.

［2］ 孔令武，孙海峰.现代实用中药栽培养殖技术［M］.人民卫生出版社，2000：202-205.

［3］ 鱼亚琼，邱黛玉，蔺海明，等.外源激素和种苗大小对当归成药期生理变化的影响［J］.湖南农业科学，2011（9）：41-44.

［4］ 武延安，刘效瑞，曹占凤，等.日光温室冬季育苗抑制当归早期抽薹的效应研究［J］.中国中药杂志，2005，35（3）：283-284.

［5］ 张世瑜，郑国昌.当归愈伤组织诱导和植株再生［J］.植物学报，1982，24（6）：512-518.

［6］ 张顺培，贾敬芬，李浩日，等.当归原生质体的分离培养和愈伤组织的形成［J］.科学通报，1985（18）：1 423-1 425.

［7］ 张世瑜，郑国昌.当归胚性愈伤组织的诱导及胚状体发生的组织细胞学研究田［J］.植物学报，1986，28（3）：241-244.

［8］ 张俊莲，米受恩，栾文举.当归愈伤组织产生的影响因素分析［J］.甘肃农业科技，1995（11）：8-10.

［9］ 张俊莲.当归愈伤组织的再分化及植株再生［J］.甘肃农业大学学报，1995，12（3）：293-297.