辣椒制品中罗丹明B的基质固相分散提取条件优化

韦 娜 ， 王 煜 ， 张孝芳 ， 冯叙桥 ， 齐小花 ， 邹明强 *

（1.中国检验检疫科学研究院 装备技术研究所，北京 100123；2.沈阳农业大学 食品学院，辽宁 沈阳 110161；3.国家认可中心，北京 100062）

罗丹明B（Rhodamine B），又称四乙基罗丹明，碱性玫瑰精，玫瑰红B，俗称花粉红，是一种具有鲜桃红色的人工合成的染料，属于咕吨系列的衍生物[1]。缩写为RhB，分子式为C28H31ClN2O3，相对分子质量为479.017 5，其结构式见图1。罗丹明B易溶于水和乙醇等有机溶剂，呈玫瑰红色溶液，稀释后有强烈的荧光产生，微溶于盐酸和氢氧化钠溶液。因其颜色鲜亮，价格便宜，许多不法商贩将其加入到辣椒面和辣椒油等辣椒制品中以达到颜色的效果。中国卫生部将罗丹明B列入《食品中可能违法添加的非食用物质和易滥用的食品添加剂品种名单（第一批）》中，禁止在食品中使用[2]。

图1 罗丹明B的结构Fig.1 Structure of rhodamine B

目前，检测辣椒制品中罗丹明B的国家标准尚未出台，而只有一些地方标准和行业标准[3]。据文献报道，检测罗丹明B所采用的样品前处理方式也多为液液萃取或固相萃取[4-5]，所需的有机溶剂种类多、调配复杂，实验所需耗材多、成本高。本实验中采用改进后的基质固相分散萃取技术，针对具有代表性的3种辣椒制品即辣椒面、辣椒油和辣椒酱进行正交试验，选用分散剂种类、分散剂与样品质量比、洗脱剂组成及洗脱剂用量作为优化因素[6-9]，确定前处理过程中的最佳条件，利用高效液相色谱法进行罗丹明B测定。

1 材料与方法

1.1 标准品与试剂

标准物质罗丹明B，Sigma公司产品，纯度99.5%；乙腈，国药北京化学试剂有限公司产品，色谱纯；甲醇，国药北京化学试剂有限公司产品，色谱纯；甲酸，国药北京化学试剂有限公司产品，分析纯；C18填料，国药北京化学试剂有限公司产品；弗罗里硅土，国药北京化学试剂有限公司产品；中性氧化铝，国药北京化学试剂有限公司产品；硅胶，国药北京化学试剂有限公司产品。

1.2 仪器与设备

BS224S电子分析天平，北京赛多利斯仪器系统有限公司制造；MS1涡旋振荡器，德国IKA公司制造；KQ-2500E超声清洗机，昆山市超声仪器有限公司制造；3K30型离心机，北京赛多利斯仪器系统有限公司制造；MTN-2800D氮吹仪，天津安特赛恩斯仪器有限公司制造；玻璃研钵和杵，北京市宏捷成生物科技有限公司提供。

1.3 提取工艺

对传统的基质固相分散萃取技术进行改进，将1 g加有罗丹明B标准品的辣椒制品置于玻璃研钵中，混合均匀，加入分散剂，用研棒充分研磨，研磨后移入试管中，加入洗脱剂，振摇均匀，超声10 min进行充分洗脱，取提取液于45℃下氮吹浓缩至干，用乙腈将其复溶定容至1 mL，过0.22 μm有机滤膜。

1.4 标准曲线的制作

配制罗丹明B的标准溶液，质量浓度为0.01 μg/mL、 0.05 μg/mL、 0.2 μg/mL、 1 μg/mL、 5 μg/mL 和10 μg/mL，以相对应的质量浓度为横坐标，以峰面积为纵坐标，制作标准曲线。

1.5 罗丹明B含量的测定条件

采用高效液相色谱法测定溶液中罗丹明B的含量。色谱柱：SB C18 4.6 mm×50 mm，1.8 μm；检测波长550 nm；柱温 35℃；进样量 10 μL；体积流量1.0 mL/min；流动相：乙腈/质量分数0.2%甲酸溶液（体积比 65∶35）。

1.6 正交试验设计

选择分散剂种类、分散剂与样品质量比、洗脱剂组成及洗脱剂用量作为研究因素，其中分散剂与洗脱剂的选用原则主要是相似相溶原理，在尽可能提取出样品中目标物的同时尽量保留样品中其他成分，避免这些成分对目标物检测产生干扰。实验最终以提取液中的罗丹明B萃取率为考察指标，通过L16（45）正交试验，选出最佳的辣椒制品中罗丹明B的提取条件，因素水平表见表1。

表1 正交试验设计Table 1 Orthogonal design

2 结果与分析

2.1 标准曲线

根据溶液中罗丹明B浓度与峰面积相对应的关系，绘制的标准曲线如图2所示，得出的回归方程为：y=116.252 4x+0.660 1，在 0.01～10 μg/mL 质量浓度范围内线性关系良好，相关系数为0.999 9。

图2 罗丹明B标准品溶液标准曲线Fig.2 Rhodamine B standard curve

2.2 正交试验结果与讨论

本实验中考察了4个因素和4个水平，选择L16（45）正交表，其中一列为空列。正交实验设计及各个辣椒制品的实验结果见表2—4。

由表2、表3和表4中对罗丹明B提取率的R值进行的分析，可以得出影响罗丹明B提取率的因素大小关系为：D>A>B>C，洗脱剂的选择影响作用最大，分散剂的选择影响作用次之，洗脱剂的用量影响作用最小。根据各表中K值比较，确定辣椒面最佳的提取工艺条件为D3A4B3C2，即洗脱剂为质量分数80%的乙腈水溶液，分散剂硅胶，分散剂与样品质量比例1∶1，洗脱剂体积20 mL；辣椒油最佳的提取工艺条件为D4A3B1C2，洗脱剂为体积分数80%的甲醇水溶液，分散剂中性氧化铝，分散剂与样品质量比例2∶1，洗脱剂体积20 mL；辣椒酱最佳提取工艺条件为D3A3B2C4，洗脱剂为质量分数80%的乙腈水溶液，分散剂为中性氧化铝，分散剂与样品质量比例3∶1，洗脱剂体积5 mL。前两种辣椒制品的最佳洗脱剂体积均为考察范围内的最大值20 mL，通过进一步研究，增加洗脱剂体积对罗丹明B的萃取没有更大贡献，所以考虑到实验成本及环保，最终选择20 mL最宜。

表5、表6和表7更深入地分析了4个因素对实验结果的影响程度，从3个表中可以看出，洗脱剂和分散剂的选择对实验结果影响显著，其次分散剂与样品质量比例的影响较前两者弱，洗脱剂的用量对实验结果影响最不显著，各因素对实验结果的影响显著性依次为：因素D （洗脱剂组成）>因素A（分散剂种类）>因素B（分散剂与样品质量比例）>因素C（洗脱剂用量），此方差分析结果与极差分析结果一致。

2.3 实验结果验证与讨论

通过对正交试验结果的极差与方差分析确定的辣椒面的最佳组合为A4B3C2D3，即分散剂硅胶，分散剂与样品质量比例1∶1，洗脱剂用量20 mL，洗脱剂选择质量分数80%的乙腈水溶液；辣椒油的最佳组合为A3B1C2D4，即分散剂为中性氧化铝，分散剂与样品质量比例2∶1，洗脱剂用量20 mL，洗脱剂为体积分数80%的甲醇水溶液；辣椒酱的最佳组合是A3B2C4D3，即分散剂为中性氧化铝，分散剂与样品质量比例3∶1，洗脱剂用量5 mL，洗脱剂用质量分数80%的乙腈水溶液。将这3种代表性的辣椒制品的空白样中分别添加质量浓度为100 μg/mL的罗丹明B标准溶液，使样品中目标物质的质量浓度分别为 0.2 μg/mL、1 μg/mL 和 5 μg/mL， 按照分别的前处理最优条件对每个样品的每一质量浓度进行5次检测，最后取平均值，经由标准曲线计算得到各溶液中罗丹明B的浓度。经计算目标物回收率在80.6%～100.8%（见表8），可以达到痕量分析的要求。

表2 辣椒面样品正交实验表及结果Table 2 Orthogonal results of Chili Powder

表3 辣椒油样品正交实验表及结果Table 3 Orthogonal results of Pepper Oil

续表3

表4 辣椒酱样品正交实验表及结果Table 4 Orthogonal results of Chili Paste

续表4

表5 辣椒面样品正交实验方差分析Table 5 Orthogonal analysis of variance of Chili Powder

表6 辣椒油样品正交实验方差分析Table 6 Orthogonal analysis of variance of Pepper Oil

表7 辣椒酱样品正交实验方差分析Table 7 Orthogonal analysis of variance of Chili Paste

表8 辣椒样品中罗丹明B回收率Table8 Recovery of Rhodamine B in Chili sample

3 结语

利用改进后的基质固相分散技术的正交试验，进行辣椒制品中罗丹明B的提取工艺的研究，并对实验结果进行极差和方差分析，得到最优提取工艺条件，如表9所示。

表9 辣椒样品中罗丹明B最优提取条件Table 9 Optimal extraction conditions of Rhodamine B in Chili sample

同时对实验结果进行验证，确定在各自的最优条件下，3种辣椒产品中罗丹明B的最高提取率分别为：辣椒面100.8%，辣椒油99.7%，辣椒酱98.3%。

实验操作简单，有机溶剂种类少，只用到了乙腈和甲醇，改进后省去了固相萃取小柱，避免了在液液萃取或固相萃取过程中，可能由于所用有机溶剂复杂，或萃取小柱批次不同而导致的实验结果不稳定，或目标物残留在柱上等会影响目标物回收率的情况产生，并且节省了实验成本。

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