利用枯草芽孢杆菌发酵生产环磷腺苷的工业化试验

朱晓宏， 朱晓慧， 魏 薇

（江苏省微生物研究所有限公司，江苏 无锡 214063）

环磷腺苷具有调节生物体内很多酶催化反应的功能，体内很多激素的作用也是通过环磷腺苷区进行的，起着激素媒介物质的作用[1]。

现已证明环磷腺苷（cAMP）是睾丸甾酮、雌激素、肾上腺激素、甲状腺激素及胎盘激素等许多激素的第二信使。当各种激素与细胞表面作用点接触时，发动细胞内三磷酸腺苷（ATP）转化成环磷腺苷（cAMP）。细胞内环磷腺苷的浓度变化又引起了细胞各种代谢的变化。而且环磷腺苷与细胞内蛋白质合成、脂肪分解、类固醇合成均有关系。环磷腺苷与恶性肿瘤、内分泌之间的关系十分密切。在特定条件下，环磷腺苷对癌细胞具有控制作用，对冠心病、牛皮癣等有缓解作用。

目前在我国，环磷腺苷主要作为医药品被应用。环磷腺苷在医药上主要作为急性心肌梗塞抢救药并用于冠心病、糖尿病、气喘、牛皮癣等疾病的治疗。

目前国内环磷腺苷的生产方法全是化学合成方法[2]。包括：

1）碱性水解法：David lipkin等人在1959年曾用碱性水解的工艺方法制得了环磷腺苷。此法主要是利用三磷酸腺苷（ATP）100℃时在氢氧化钡强碱水溶液中水解并关环制得环磷腺苷。

2）活性酯类法：河北大学韩文炎和屠宛蓉在1986年报道了环磷腺苷的改进合成工艺方法。5-腺苷酸、4-吗啡啉-N，N-二环己基脒和金属钠在乙二醇单甲醚溶剂中反应，合成了环磷腺苷。

3）DCC 脱水法[3]：M．Smith等在 1961年用 5 一腺苷酸和4一吗啡啉一N，N一二环己基脒在吡啶溶剂中，用DCC作脱水剂进行脱水反应，使5-腺苷酸发生内酯化反应，产物的收率可达80%。

4）三氯氧磷法：1989年，Genieser等报道了腺苷与三氯氧磷反应得到腺苷的合成工艺路线。中间体腺苷二氯磷酸酯不经过分离，加碱环化得到环磷腺苷。此法原料容易得到，反应条件温和适中，但收率偏低（49%）。

但以上方法全都属于化学合成方法，反应所需原料都具有毒性和污染，且工业化生产过于昂贵。

1 材料与方法

1.1 菌种

作者所在研究室筛选育种得到的Bacillus.subtilis jsim-1277。该菌株与目前国内鸟苷发酵菌种Bacillus.subtilis jsim-G518[4]相似，同样源自肌苷产生菌Bacillus.subtilis jsim-1019。

1.2 培养基

1.2.1 种子培养基 葡萄糖2.0 g/dL，蛋白胨1.0 g/dL，玉米浆 0.3 g/dL，NaCl 0.3 g/dL，pH 7.0。 （固体培养基加琼脂2 g/dL）

1.2.2 发酵培养基 葡萄糖6.0 g/dL，尿素1.0 g/dL，酵母粉1.0 g/dL，豆饼水解液0.3 g/dL，K2HPO41.0 g/dL，NaF 0.05 g/dL，MgSO40.1g/dL，pH 7.0。

1.3 摇瓶发酵试验

1.3.1 摇瓶种子培养 接一环生长良好的斜面培养物，至装有30 mL种子培养基的500 mL三角瓶中培养，旋转式摇床，频率 210 r／min，温度 36℃，培养18 h。

1.3.2 摇瓶发酵培养 将生长良好的种子液接至装有30 mL发酵培养基的500 mL三角瓶中培养，接种体积分数10%，旋转式摇床，频率210 r／min，温度36℃，培养72 h后测定环磷腺苷质量浓度。

1.4 自控发酵罐试验

自控发酵罐，容量30 L，温度、转速、溶氧、补料、灭菌均自控。种子用摇瓶培养，培养时间18 h，接种体积分数10%。发酵液装量21 L，121℃灭菌15 min，温控 36 ℃，通气搅拌[5]。

1.5 20 M3环磷腺苷发酵试验

标准型不锈钢发酵罐，二组六弯型搅拌，转速可调，容量 20 M3，装液 14 M3，pH、溶氧在线显示，液氨调节pH装置。标准型不锈钢种子罐，六弯型搅拌转速可调，容量 2 M3，装液 1.4 M3，pH、溶氧在线显示。

1.6 分析方法

高效液相色谱法。用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以0.05 mol/L磷酸二氢钾溶液（含0.01 mol/L四丁基溴化铵，用磷酸调节pH值至4.3）-乙腈（85∶15）为流动相，检测波长为 258 nm。标准品溶液0.2 mg/mL，取20 μL注入液相色谱仪，按外标法以峰面积计算测定。

2 结果与分析

2.1 氟化钠（NaF）质量浓度对发酵的影响

发酵培养基中添加不同质量浓度的腺苷酸环化酶促进剂NaF，环磷腺苷的发酵水平见表1。

表1 NaF质量浓度对环磷腺苷发酵的影响Table 1 Effect of various concentration of NaF on cAMP accumulation

NaF作为一种腺苷酸环化酶促进剂，适当添加可促使产品积累，0.05 g/dL是合适的。

2.2 磷酸氢二钾（K2HPO4）质量浓度对发酵的影响

发酵培养基中添加不同质量浓度的K2HPO4，环磷腺苷的发酵水平见表2。

表2 K2HPO4对环磷腺苷发酵的影响Table 2 Effect of various concentration of K2HPO4on cAMP accumulation

Bacillus.subtilis jsim-1277积累环磷腺苷不同于其原始菌株Bacillus.subtilis jsim-X-13-4。后者积累腺苷，不需要额外提供磷酸[6]；而前者需要提供磷酸盐以生成环磷酸基团。从实验可知，K2HPO4在1 g/dL以下时，质量浓度升高，产酸能力也升高；而质量浓度更高时，产酸能力不再提高，分析1 g/dL K2HPO4已能提供生产足够的磷酸基团。过高的磷酸盐质量浓度会增加提取的压力，故选择1 g/dL K2HPO4最为合适。

2.3 pH对发酵的影响

自动罐发酵过程中pH自然下降后，用液氨或氨水控制不同pH，环磷腺苷产量见表3。

表3 不同pH对环磷腺苷发酵的影响Table 3 Effect of various pH on cAMP accumulation

通过试验知道，pH 6.7适合环磷腺苷的积累。

2.4 20 M3环磷腺苷发酵

种子罐2 M3，装液1.4 M3，配料按材料与方法所述。种子液灭菌后调pH 7．0，接人3只茄子瓶斜面，温度 36℃ ，风量 1∶0．3，培养过程中不控制 pH。培养至18 h左右，pH降至6．0左右，镜检无杂菌，且大部分已断裂，即移种至发酵罐。

发酵罐20 M3，装液14 M3，配料按材料与方法所述。灭菌后用液氨调pH 7.0。培养温度36℃，种子接入发酵后，起始风量设置为1∶0.25，在12 h内逐步增至最大，为1∶0.8。发酵过程中不断取样检测产物积累量。发酵到后期，pH有上升趋势，溶氧急速增加，环磷腺苷不再增长，则放罐。

表4 20 M3发酵罐中环磷腺苷发酵状况Table 4 ccAMP fermentation in 20 M3fermentor

20 M3发酵罐5批次平均生产环磷腺苷6.2 g/L，平均发酵周期62 h。菌种生产能力稳定。

3 结语

经改造的枯草芽孢杆菌Bacillus.subtilis jsim-1277具有良好环磷腺苷生产能力，在最佳pH 6.7条件下，以葡萄糖为碳源、尿素、酵母粉、豆饼水解液为复合氮源，添以1 g/dL的K2HPO4和0.05 g/dL的NaF，能生产环磷腺苷6～7 g/L，发酵周期60 h略多，有较好的工业化价值。

[1]Shandar R R，Zhu J S，Baron A D.Glueosamine infusion in rat smimics the beta-cell dysfunction of non-insulin-dependent diabetes mellitus[J].Metabolism，l998，47：573．

[2]申艳红，张文升，刘启宾，等.环磷腺苷的合成[J].中国医药工业杂志，2004：35（3）：132.SHEN Yanhong，ZHANG Wensheng，LIU Qibin，et al.Synthesis of adenosine cyclophospha [J].Chinese Journal of Pharmaceuticals，2004，35（3）：132.（in Chinese）

[3]Borden R K，Smith M.Nucleoside synthesis III.Preparation of nucleoside 3’，5’-cyclic phosphate in strong base[J].J Org Chem，1966，31：3247-3258.

[4]盛翠，张一平，陆茂林.原生质体紫外诱变选育鸟苷高产菌株[J].食品与生物技术学报，2009，28（2）：279-283.SHENG Cui，ZHANG Yiping，LU Maolin.Study on breeding up high-yield strain of guanosine by protoplast mutagensis[J].Journal of Food Science and Biotechnology，2009，28（2）：279-283.（in Chinese）

[5]杜郭君，张一平，王红连，等.鸟嘌呤核苷补料发酵条件研究[J].食品与生物技术学报，2005，24（5）：21-24.DU Guojun，ZHANG Yiping，WANG Honglian，et al.Studies on feeding condition of guanosine fermentation[J].Journal of Food Science and Biotechnology，2005，24（5）：21-24.（in Chinese）

[6]柏建新，朱晓宏，张一平，等.肌苷菌核酸代谢关键酶缺失和形成选育腺苷茵的研究[J].微生物学通报，2003，30（2）：52-56.BAI Jianxin，ZHU Xiaohong，ZHANG Yiping，et al.Study on the microorganism fermentation of adenosine with mutative strains of lack of or producing some important enzymes in nucleic acid metabolism[J].Microbiology，2003，30（2）：52-56.（in Chinese）