低聚糖对乳酸片球菌体外增殖和抑菌效果的影响

王 津， 周志江， 韩 烨， 陈 颖， 范 寰

（1.天津大学化工学院，天津南开 300072；2.天津市林业果树研究所，天津西青 300384；3.天津市畜牧兽医研究所，天津西青 300384）

益生元是指能使肠道中有益菌活化的物质，它不能被宿主消化吸收却能选择性地促进肠道中有益菌的生长、繁殖，主要包括低聚糖、多糖、天然植物提取物、蛋白水解物、多元醇等（Mookiah等，2014；于晓燕和朱京慈，2008）。 目前饲料中添加的主要是低聚糖类益生元。在实践应用中低聚糖与益生素配合使用，促进益生菌在肠道的增殖及定植，抑制肠道腐败菌的生长（Liong和Shah，2005）。本试验探讨低聚木糖、低聚果糖、低聚半乳糖、壳寡糖、异麦芽糖和甘露寡糖等对乳酸片球菌体外增殖和抑菌效果影响，为乳酸片球菌与低聚糖配伍使用提供一定的理论科学依据。

1 材料与方法

1.1 菌株 乳酸片球菌（Pediococcus acidilactici）PA003由天津大学食品科学系食品生物技术实验室保存；单核细胞增多症李氏杆菌（Lister monocytogenes）CVCC1591，购于中国兽药监察中心。

1.2 低聚糖 低聚木糖含量 （以干物质计）≥90%；低聚果糖含量（以干物质计）≥95%；低聚半乳糖含量（以干物质计）≥95%；壳寡糖含量（以干物质计）≥95%；异麦芽糖含量 （以干物质计）≥90%；甘露寡糖含量（以干物质计）≥90%。以上低聚糖均为市购。

1.3 培养基 MRS基础培养基：葡萄糖2 g，酵母提取物 0.5 g，胰蛋白胨1 g，牛肉膏1 g，磷酸氢二钾0.2 g，乙酸钠0.5 g，柠檬酸铵0.2 g，硫酸镁0.058 g，硫酸锰 0.025 g，吐温-80 0.1 g，水 100 mL，pH 6.5。

试验培养基：分别以低聚木糖、低聚果糖、低聚半乳糖、壳寡糖、异麦芽糖和甘露寡糖取代基础培养基中的葡萄糖作为碳源配制而成，其他成分同基础培养基。

TSYEB培养基：葡萄糖0.25 g，胰蛋白胨1.7 g，酵母提取物0.6 g，大豆蛋白胨0.3 g，氯化钠0.5 g，磷酸氢二钾 0.25 g，水 100 mL，pH 7.1 ～ 7.5。

1.4 菌株活化 将乳酸片球菌PA003以0.1%接种于MRS液体培养基中，于37℃恒温培养箱中培养18 h。使用平板计数细菌的浓度，调整其浓度为109cfu/mL，备用。抑菌试验指示菌为单核细胞增多症李氏杆菌，以1%接种于TSYEB液体培养基中，于37℃恒温培养箱中培养18 h。使用平板计数细菌的浓度，调整其浓度为109cfu/mL，备用。

1.5 不同种类低聚糖对乳酸片球菌增殖的影响分别以2%（m/V）的低聚木糖、低聚果糖、低聚半乳糖、壳寡糖、异麦芽糖和甘露寡糖取代基础培养基的葡萄糖为处理组，葡萄糖培养基为对照组，采用平板计数法考察不同种类低聚糖对乳酸片球菌增殖的影响。将活化后的乳酸片球菌菌悬液，按10倍梯度稀释法稀释，选择合适的稀释度，涂布接种于预先倾注好的MRS基础培养基及试验培养基平板，37℃恒温培养24 h。取出各平板，观察菌落生长情况，分别计数各稀释度平板表面生长的菌落数，以菌落数为50～300的平板为统计对象，计算乳酸片球菌增殖的菌落数（cfu/mL），每个处理设3个重复。

1.6 不同种类低聚糖对乳酸片球菌抑菌效果的影响 分别以2%（m/V）的低聚木糖、低聚果糖、低聚半乳糖、异麦芽糖和甘露寡糖取代基础培养基的葡萄糖为处理组，葡萄糖培养基为对照组，采用牛津杯法测定不同种类低聚糖对乳酸片球菌抑菌效果（丁成为等，2007）。将活化后的乳酸片球菌发酵液以1%接种量接种于MRS液体基础培养基及试验培养基中，37℃恒温培养24 h备用。单核细胞增多症李氏杆菌作为指示菌，测量抑菌圈直径，每个处理设3个重复。

1.7 不同浓度低聚果糖对乳酸片球菌增殖的影响 分别以0.5%、1%、2%、3%、4%（m/V）的低聚果糖取代基础培养基中的葡萄糖作为试验培养基。采用平板计数法考察不同浓度低聚果糖对乳酸片球菌增殖的影响。将活化后的乳酸片球菌菌悬液，按10倍梯度稀释法稀释，选择合适的稀释度，涂布接种于预先倾注好的试验培养基平板，37℃恒温培养24 h。菌落计数方法同1.5。

1.8 不同浓度低聚果糖对乳酸片球菌抑菌效果的影响 分别以 0.5%、1%、2%、3%、4%（m/V）的低聚果糖取代葡萄糖添加到基础培养基中。采用牛津杯法测定不同浓度低聚果糖对乳酸片球菌抑菌效果。将活化后的乳酸片球菌发酵液以1%接种量接种于不同浓度低聚果糖发酵培养基中，37℃恒温培养24 h备用。单核细胞增多症李氏杆菌作为指示菌，测量抑菌圈直径，每个处理设3个重复。

1.9 乳酸片球菌生长曲线的测定 以2%（m/V）的低聚果糖取代基础培养基中的葡萄糖作为试验培养基，葡萄糖培养基为对照组。将活化后的乳酸片球菌发酵液以1%接种量接种于基础培养基和试验培养基。37℃恒温培养24 h，每隔2 h取样测定其吸光度值，吸光度测定波长为600 nm。以培养时间为横坐标，OD600为纵坐标，绘制生长曲线。

2 结果与分析

2.1 不同种类低聚糖对乳酸片球菌增殖的影响不同种类低聚糖在相同的添加量下对乳酸片球菌增殖的影响结果见表1。由表1可知，不同种类低聚糖对乳酸片球菌的增殖影响效果不同。乳酸片球菌基本上不能利用壳寡糖。与对照组相比，低聚果糖和低聚半乳糖均促进了乳酸片球菌的增殖。低聚果糖能被乳酸片球菌选择性发酵，发酵后的菌体浓度可达到（3.08±0.54）×109cfu/mL，约是葡萄糖对照组的1.38倍，差异显著（P＜0.05）。低聚半乳糖也能促进乳酸片球菌生长，但是与葡萄糖对照组相比差异不显著（P＞0.05）。

2.2 不同种类低聚糖对乳酸片球菌抑菌效果的影响 不同种类低聚糖对乳酸片球菌抑菌效果的影响结果见表2。由表2可知，不同种类低聚糖发酵乳酸片球菌对单核细胞增多症李氏杆菌均有一定的抑制作用，抑菌圈直径为10.08～14.21 mm。与葡萄糖对照组相比，低聚果糖能明显增加乳酸片球菌抑菌性，抑菌圈直径达到14.21 mm（P＜0.05）；而低聚半乳糖作为碳源，对乳酸片球菌本身抑菌特性无明显影响（P＞0.05）。

表1 不同种类低聚糖对乳酸片球菌增殖的影响 cfu/mL

表2 不同种类低聚糖对乳酸片球菌抑菌效果的影响 mm

2.3 不同浓度低聚果糖对乳酸片球菌增殖的影响 不同浓度低聚果糖对乳酸片球菌增殖的影响结果见表3。由表3可知，低聚果糖浓度在0.5%～2%，随着低聚果糖浓度的升高，乳酸片球菌菌落数相应升高。此外，培养基中低聚果糖的含量并不是越高越好，以2%浓度的增殖效果最好，乳酸片球菌菌落数达到最大。而低聚果糖浓度达到3%时，乳酸片球菌菌落数反而下降。当低聚果糖浓度达到4%时，菌落数已经降至（0.33±0.19）×109cfu/mL。这可能是由于低聚果糖浓度过高形成高渗透压环境，菌体细胞脱水，从而抑制菌体生长。因此，2%浓度的低聚果糖为乳酸片球菌增殖的最佳浓度。

2.4 不同浓度低聚果糖对乳酸片球菌抑菌效果的影响 不同浓度低聚果糖对乳酸片球菌抑菌效果的影响结果见表4。由表4可知，低聚果糖浓度在0.5%～2%，随着低聚果糖浓度的升高，抑菌圈直径相应变大。而低聚果糖浓度达到3%时，抑菌圈直径反而略有下降。当低聚果糖浓度达到4%时，抑菌圈直径明显变小，说明，乳酸片球菌的抑菌特性受到严重抑制。这可能是由于高渗透压的低聚果糖对细菌的脱水作用，抑制了乳酸片球菌的生长，导致乳酸片球菌菌素和乳酸生成明显减少（王晶等，2013）。因此，低聚果糖浓度为2%时，乳酸片球菌达到最大抑菌活性。

表3 不同浓度低聚果糖对乳酸片球菌增殖的影响

表4 不同浓度低聚果糖对乳酸片球菌抑菌效果的影响

2.5 乳酸片球菌生长曲线的建立 乳酸片球菌液体培养后的生长曲线见图1。由图1可知，在0～24 h，与葡萄糖相比，低聚果糖作为碳源，乳酸片球菌能迅速进入对数生长期，适应期有所缩短。培养12 h后达到生长稳定期，低聚果糖组的OD值也略高于葡萄糖组。因此低聚果糖对乳酸片球菌体外生长有显著促进作用，优于葡萄糖作碳源时的生长效果。

图1 乳酸片球菌生长曲线

3 讨论

微生物的生长可用比浊法、直接涂布法、倾注培养和OD值等多种方法进行测定，本试验采用直接涂布法测定菌落形成单位（cfu/mL）。虽然比较繁琐，但因低聚木糖、壳寡糖溶解性不好，会有轻微的浑浊现象，因此比浊法和OD值的方法都会影响测定的可靠性，因此选用直接涂布法进行细菌生长的测定。

低聚糖由于其分子间结合位置及结合类型特殊，饲喂后不能被单胃动物自身分泌的消化酶分解。单胃动物消化道寄生着大量微生物，这些微生物具有切断低聚糖末端糖苷键的酶，因此低聚糖可被有益微生物利用。低聚糖可选择性促进肠道有益菌繁殖，发酵后产生乳酸、乙酸、短链脂肪酸等酸性物质。乳酸可直接作为营养物质被机体吸收，还可作为杀菌剂抑制肠道中病原菌的增殖；短链脂肪酸可通过降低肠道pH值，抑制病原菌的生长繁殖，同时通过降低肠道氧化还原电位，调节肠道蠕动，间接阻止病原菌在肠道上皮细胞的粘附定殖。低聚糖与肠上皮寡糖结构受体相似，可与病原菌的外源凝集素特异性结合，使病原菌不能在肠道上粘附，而随低聚糖通过消化道排出体外（武香玉等，2013）。

低聚果糖具有调节肠道菌群、增殖双歧杆菌和乳杆菌的作用 （项明洁等，2005）。有研究报道，低聚果糖能防止早期断奶犊牛肠道萎缩，维持肠道正常形态结构，提高犊牛免疫性能（邰秀林等，2009）。低聚果糖能促进乳杆菌和双歧杆菌的增殖并抑制肠杆菌和肠球菌的增殖 （杭锋等，2009）。本试验也得到类似结果，低聚果糖可促进乳酸片球菌的增殖，并对单核细胞增多症李氏杆菌有很好的抑菌活性。因此本试验结果为制备复合型动物微生态制剂-合生元提供了理论和科学依据。

4 结论

低聚果糖对乳酸片球菌体外生长具有显著促进作用。培养基中低聚果糖添加比例为2%时，能明显促进乳酸片球菌生长，发酵后的菌体浓度可达到（3.08±0.54）×109cfu/mL；同时也能明显提高乳酸片球菌抑菌性，抑菌圈直径达到（14.21±0.30）mm。 与葡萄糖相比，低聚果糖作为碳源，乳酸片球菌能迅速进入对数生长期，适应期有所缩短。

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