流式细胞术检测风湿性心脏病合并心房颤动患者HCN2蛋白的表达

赵春鹤+周华富+张博+孙宇+刘文洲

【摘要】 目的 对风湿性心脏病合并心房颤动患者右心耳组织超级化激活环核苷酸门控阳离子通道-2（HCN2）蛋白的表达进行分析和研究。方法 风湿性心脏病患者84例分为研究组（心房颤动）和对照组（窦性心律）， 每组42例， 对两组临床资料进行回顾性分析。结果 研究组患者的左心房内径（LAD）、右心房内径（RAD）、左心室舒张末期内径（LVEDD）明显高于对照组， 右心室内径（RVD）明显小于对照组， 两组比较差异具有统计学意义（P<0.05）；且研究组HCN2蛋白表达水平高于对照组。结论 风湿性心脏病合并心房颤动患者HCN2蛋白的表达与患者的心房颤动具有相关性。

【关键词】 心房颤动；右心耳组织超级化激活环核苷酸门控阳离子蛋白通道-2；表达

心房颤动（房颤）是最常见的持续性心律失常。随着年龄增长房颤的发生率不断增加， 75岁以上人群可达10%。房颤时心房激动的频率达300～600次/min， 心跳频率往往快而且不规则， 有时候可达100～160次/min， 不仅比正常人心跳快得多， 而且绝对不整齐， 心房失去有效的收缩功能[1]。房颤患病率的增长还与冠心病、高血压病和心力衰竭等疾病的增长密切相关。本文主要就风湿性心脏病合并心房颤动患者HCN2蛋白的表达进行分析和研究， 以期能够进一步提高患者的生命质量， 现作报告如下。

1 资料与方法

1. 1 一般资料 随机选取2013年2月～2014年2月本院收治的风湿性心脏病患者84例， 分为研究组（心房颤动）和对照组（窦性心律）， 每组42例。对照组年龄16～76岁， 平均年龄（40±6.75）岁；研究组年龄18～78岁， 平均年龄（40±6.78）岁；两组患者性别、年龄等一般资料比较差异无统计学意义（P>0.05）， 具有可比性。

1. 2 方法

1. 2. 1 培养心房肌鉴定

1. 2. 1. 1 免疫荧光法 ①滴加0.01 mol/L， pH 7.4的PBS于待检标本片上， 10 min后弃去， 使标本保持一定湿度。②滴加适当稀释的荧光标记的抗体溶液， 置于有盖搪瓷盒内， 保温30 min。③取出玻片， 置玻片架上， 先用0.01 mol/L， pH 7.4的PBS冲洗后， 再按顺序过0.01 mol/L， pH 7.4的PBS三缸浸泡， 每缸3～5 min， 不时振荡。④取出玻片， 用滤纸吸去多余水分。⑤立即用荧光显微镜观察。即可判定为阳性。

1. 2. 1. 2 免疫组化 ①石蜡切片脱蜡至水。②3% 室温孵育5～10 min。③蒸馏水冲洗， PBS浸泡5 min×2次。④5%～10%正常山羊血清封闭， 室温孵育10 min， 倾去血清， 勿洗。滴加一抗工作液， 37℃孵育1～2 h或4℃过夜。⑤PBS冲洗， 5 min×3次。⑥滴加适量生物素标记二抗工作液， 37℃ 孵育10～30 min。⑦PBS冲洗， 5 min×3次。⑧滴加适量的辣根酶或碱性磷酸酶标记的链霉卵白素工作液， 37℃孵育10～30 min。⑨显色剂显色3～15 min。⑩自来水充分冲洗， 复染、脱水、透明、封片。

1. 2. 2 培养 取风湿性心脏病患者手术常规切除右心耳组织约300 mg， 10例无房颤史， 10例有房颤史， 10 min送至培养室， 在无菌操作台下将右心耳组织剪碎约1.3 mm大小， 迅速将剪碎组织贴壁细胞培养瓶壁， 加入含10%的胎牛血清， 倒置约1 h后待组织贴壁紧密后翻转培养瓶使组织碎块浸没在培养液中， 培养3～6 d可见组织块周边细胞生长， 10 d左右待细胞长满瓶底约80%可传代。取第三代传代细胞， 做细胞爬片， 用人抗兔&-肌动蛋白抗体， 兔抗鼠fitc标记的二抗用免疫荧光法鉴定培养细胞为人心房肌细胞， 免疫组化法鉴定人心房肌细胞：人抗兔&-肌动蛋白抗体。流式细胞术检测第三代细胞， 将贴壁细胞消化下来做流式样品管， 检测风湿性心脏病房颤史患者HCN2基因蛋白表达高于风湿性心脏病无房颤患者[2]。

1. 3 统计学方法 所有数据均采用SPSS17.0统计学软件对数据进行统计学分析。计量资料以均数±标准差（ x-±s）表示， 采用t检验；计数资料采用χ2检验。P<0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2. 1 两组临床相关因素对照 研究组患者的左心房内径（LAD）、右心房内径（RAD）、左心室舒张末期内径（LVEDD）明显高于对照组， 右心室内径（RVD）明显小于对照组， 差异具有统计学意义（P<0.05）。两组患者的左心室射血分数（LVEF）差异无统计学意义（P>0.05）， 左心房内径与心房颤动的发生成正比， 左心室舒张末期内径、左心室射血分数与心房颤动成负相关， 见表1。

2. 2 两组患者临床资料比较 两组临床资料比较差异具有统计学意义（P<0.05）， 研究组患者的HCN2蛋白表达明显高于对照组， 见表2。

3 讨论

风湿性心脏病简称风心病， 是指由于风湿热活动， 累及心脏瓣膜而造成的心脏瓣膜病变。表现为二尖瓣、三尖瓣、主动脉瓣中有一个或几个瓣膜狭窄和（或）关闭不全。临床上狭窄或关闭不全常同时存在， 但常以一种为主。患病初期常常无明显症状， 后期则表现为心慌气短、乏力、咳嗽、下肢水肿、咳粉红色泡沫痰等心功能失代偿的表现。本病多发于冬春季节， 寒冷、潮湿和拥挤环境下， 初发年龄多在5～15岁， 复发多在初发后3～5年内。由于心脏瓣膜的病变， 使得心脏在运送血液的过程中出现问题， 如瓣膜狭窄， 使得血流阻力加大， 为了射出足够的血液， 心脏则更加费力地舒张和收缩， 这样使心脏工作强度加大， 效率降低， 心脏易疲劳， 久而久之造成心脏肥大。如二尖瓣狭窄到一定程度时由于左心房压力的增高， 导致肺静脉和肺毛细血管压力增高， 形成肺淤血， 肺淤血后容易引起以下症状：①呼吸困难；②咳嗽；③咳血， 有的还会出现声音沙哑和吞咽困难， 严重的影响着人们的健康生活以及生活质量[3]。

流式细胞术是一种在功能水平上对单细胞或其他生物粒子进行定量分析和分选的检测手段， 它可以高速分析上万个细胞， 并能同时从一个细胞中测得多个参数， 与传统的荧光镜检查相比， 具有速度快、精度高、准确性好等优点， 成为当代最先进的细胞定量分析技术。其在液流系统中， 快速测定单个细胞或细胞器的生物学性质， 并把特定的细胞或细胞器从群体中加以分类收集的技术。其特点是通过快速测定库尔特电阻、荧光、光散射和光吸收来定量测定细胞 DNA含量、细胞体积、蛋白质含量、酶活性、细胞膜受体和表面抗原等许多重要参数。根据这些参数将不同性质的细胞分开， 以获得供生物学和医学研究用的纯细胞群体， 目前最高分选速度已达到每秒钟3万个细胞[4-6]。

研究表明， 研究组患者的左房内径、左室舒张末期内径、右房内径均明显增大， 然而右室内径减小， 左室射血分数降低；且研究组HCN2蛋白表达水平高于对照组， 两组比较， 差异具有统计学意义（P<0.05）。

综上所述， 风湿性心脏病合并心房颤动患者HCN2蛋白的表达与患者的心房颤动具有相关性。

参考文献

[1] 张复贵， 朱小琴， 李元红， 等.风湿性心脏病患者发生心房颤动的临床因素分析.中国心脏起搏与心电生理杂志， 2011， 25（6）：520-521.

[2] 任宇超， 张岚， 刘靖童.风湿性心脏病患者发生心房颤动的临床因素分析.当代医学， 2013， 19（31）：80-82.

[3] 刘雄涛， 苏菲菲， 尚福军， 等.人类心房肌细胞的原代培养与鉴定.科学技术与工程， 2014， 14（2）：6-7.

[4] 刘慧， 于风旭， 毛亮.风湿性心脏病心房颤动患者 HCN2蛋白 的表达.中国心脏起搏与心电生理杂志， 2013， 27（1）：36-38.

[5] 刘文洲， 孙宇王， 俊龙.二尖瓣狭窄合并心房颤动患者HCN2表达与测序.临床心血管病杂志， 2014， 1（25）：56-57.

[6] 李勇， 马瑞彦， 肖颖彬， 等. 风湿性二尖瓣病变并发心房颤动患者483例临床分析. 第三军医大学学报， 2011， 33（10）：1048-1051.

[收稿日期：2014-09-03]

流式细胞术是一种在功能水平上对单细胞或其他生物粒子进行定量分析和分选的检测手段， 它可以高速分析上万个细胞， 并能同时从一个细胞中测得多个参数， 与传统的荧光镜检查相比， 具有速度快、精度高、准确性好等优点， 成为当代最先进的细胞定量分析技术。其在液流系统中， 快速测定单个细胞或细胞器的生物学性质， 并把特定的细胞或细胞器从群体中加以分类收集的技术。其特点是通过快速测定库尔特电阻、荧光、光散射和光吸收来定量测定细胞 DNA含量、细胞体积、蛋白质含量、酶活性、细胞膜受体和表面抗原等许多重要参数。根据这些参数将不同性质的细胞分开， 以获得供生物学和医学研究用的纯细胞群体， 目前最高分选速度已达到每秒钟3万个细胞[4-6]。

研究表明， 研究组患者的左房内径、左室舒张末期内径、右房内径均明显增大， 然而右室内径减小， 左室射血分数降低；且研究组HCN2蛋白表达水平高于对照组， 两组比较， 差异具有统计学意义（P<0.05）。

综上所述， 风湿性心脏病合并心房颤动患者HCN2蛋白的表达与患者的心房颤动具有相关性。

参考文献

[1] 张复贵， 朱小琴， 李元红， 等.风湿性心脏病患者发生心房颤动的临床因素分析.中国心脏起搏与心电生理杂志， 2011， 25（6）：520-521.

[2] 任宇超， 张岚， 刘靖童.风湿性心脏病患者发生心房颤动的临床因素分析.当代医学， 2013， 19（31）：80-82.

[3] 刘雄涛， 苏菲菲， 尚福军， 等.人类心房肌细胞的原代培养与鉴定.科学技术与工程， 2014， 14（2）：6-7.

[4] 刘慧， 于风旭， 毛亮.风湿性心脏病心房颤动患者 HCN2蛋白 的表达.中国心脏起搏与心电生理杂志， 2013， 27（1）：36-38.

[5] 刘文洲， 孙宇王， 俊龙.二尖瓣狭窄合并心房颤动患者HCN2表达与测序.临床心血管病杂志， 2014， 1（25）：56-57.

[6] 李勇， 马瑞彦， 肖颖彬， 等. 风湿性二尖瓣病变并发心房颤动患者483例临床分析. 第三军医大学学报， 2011， 33（10）：1048-1051.

[收稿日期：2014-09-03]

流式细胞术是一种在功能水平上对单细胞或其他生物粒子进行定量分析和分选的检测手段， 它可以高速分析上万个细胞， 并能同时从一个细胞中测得多个参数， 与传统的荧光镜检查相比， 具有速度快、精度高、准确性好等优点， 成为当代最先进的细胞定量分析技术。其在液流系统中， 快速测定单个细胞或细胞器的生物学性质， 并把特定的细胞或细胞器从群体中加以分类收集的技术。其特点是通过快速测定库尔特电阻、荧光、光散射和光吸收来定量测定细胞 DNA含量、细胞体积、蛋白质含量、酶活性、细胞膜受体和表面抗原等许多重要参数。根据这些参数将不同性质的细胞分开， 以获得供生物学和医学研究用的纯细胞群体， 目前最高分选速度已达到每秒钟3万个细胞[4-6]。

研究表明， 研究组患者的左房内径、左室舒张末期内径、右房内径均明显增大， 然而右室内径减小， 左室射血分数降低；且研究组HCN2蛋白表达水平高于对照组， 两组比较， 差异具有统计学意义（P<0.05）。

综上所述， 风湿性心脏病合并心房颤动患者HCN2蛋白的表达与患者的心房颤动具有相关性。

参考文献

[1] 张复贵， 朱小琴， 李元红， 等.风湿性心脏病患者发生心房颤动的临床因素分析.中国心脏起搏与心电生理杂志， 2011， 25（6）：520-521.

[2] 任宇超， 张岚， 刘靖童.风湿性心脏病患者发生心房颤动的临床因素分析.当代医学， 2013， 19（31）：80-82.

[3] 刘雄涛， 苏菲菲， 尚福军， 等.人类心房肌细胞的原代培养与鉴定.科学技术与工程， 2014， 14（2）：6-7.

[4] 刘慧， 于风旭， 毛亮.风湿性心脏病心房颤动患者 HCN2蛋白 的表达.中国心脏起搏与心电生理杂志， 2013， 27（1）：36-38.

[5] 刘文洲， 孙宇王， 俊龙.二尖瓣狭窄合并心房颤动患者HCN2表达与测序.临床心血管病杂志， 2014， 1（25）：56-57.

[6] 李勇， 马瑞彦， 肖颖彬， 等. 风湿性二尖瓣病变并发心房颤动患者483例临床分析. 第三军医大学学报， 2011， 33（10）：1048-1051.

[收稿日期：2014-09-03]