甘蔗品种R O C 2 2组织培养体系中G 4 1 8的浓度筛选

刘家仪 ，杨丽涛 1，，李杨瑞 1，

（1.亚热带农业生物资源保护与利用国家重点实验室/广西大学农学院，南宁 530005；2.中国农业科学院甘蔗研究中心/广西农业科学院甘蔗研究所，农业部广西甘蔗生物技术与遗传改良重点实验室/广西甘蔗遗传改良重点实验室，南宁 530007）

我国甘蔗80%以上种植在旱坡地上，大部分没有灌溉条件，适应旱坡地的高产高糖甘蔗良种及先进适用的旱地甘蔗栽培技术显得日益重要[1]。融合了分子标记、杂交选育等常规手段的农作物生物育种技术，是现代农业科技创新与产业化的重要领域，带来了巨大的经济、社会和生态效益[2]。可见，利用农作物生物育种技术培育适应旱坡地的高产高糖甘蔗品种是可行高效的方法。G418（geneticin）在水稻、小麦、甘蔗的抗性筛选利用上已有一些报道[3-5]，但不同作物或同一作物不同品种的适宜浓度差异较大[6]。甘蔗基因工程研究最初以抗除草剂和抗虫转基因研究为主，随后抗病、非生物胁迫转基因、转基因甘蔗作为生物反应器生产重组蛋白（GM-CSF等）和生物塑料聚羟基丁酸酯（PHB）也取得了很好的成果[7]。目前澳大利亚、巴西、哥伦比亚、美国、中国、毛里求斯以及南非等国的甘蔗转基因研究都取得了显著进展[8]。但是，甘蔗生物育种技术还存在转化效率低、转基因甘蔗安全性问题研究比较少、多基因对甘蔗进行转化比较少等一些问题[9]。甘蔗愈伤组织的获得主要有两种方法，一是诱导嫩叶外植体产生愈伤组织，二是诱导茎顶端生长点产生愈伤组织。研究发现茎尖定芽的组织培养变异性小且繁殖速度快[10-12]。NTPⅡ筛选标记基因使植物细胞产生对氨基糖苷类抗生素如G418、卡那霉素（kanamycin）等的抗性[6]。单子叶植物对卡那霉素表现出很高的天然抗性，特别是甘蔗经卡那霉素处理后，出现非常严重的白化苗现象[13]。通过基因枪或农杆菌进行植物基因工程育种的关键环节之一是建立一个高效的组织培养再生体系[14]。ROC22是广西的主栽品种，通过和其它品种的比较发现其整体性状相对比较好[15]，但是这个品种的筛选浓度目前还未见报道。筛选甘蔗品种ROC22茎尖组织培养每个阶段的最佳G418浓度，为通过遗传转化改良甘蔗品种提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 植物材料 甘蔗品种ROC22，由广西大学甘蔗研究所提供。

1.1.2 试剂和药品 G418购自生工生物工程（上海）有限公司、其他常规药均为国产分析纯。

1.2 试验方法

1.2.1 甘蔗愈伤组织培养 选取生长旺盛、大小基本一致的愈伤组织（直径约为3 mm），每个培养皿接种4个甘蔗愈伤，设3个G418浓度梯度：0（CK）、10、20 mg/L，每个浓度设3个重复。用继代培养基（CM2）：MS+2 mg/L 2,4-D+30 g/L蔗糖+6.5 mg/L琼脂粉，pH=5.8培养，在25～27℃黑暗条件下培养，诱导再生愈伤组织，每两个星期换一次培养基。

1.2.2 甘蔗分化培养 选取生长旺盛的大小基本上一致的愈伤组织（直径约为3 mm），每个组培瓶接种3个甘蔗愈伤，设 5 个 G418 浓度梯度：0（CK）、10、20、30、40 mg/L，每个浓度设 3 个重复。 在分化培养基（CM3）：MS+2 mg/L 6-BA+1 mg/L NAA+30 g/L蔗糖+6.5 mg/L琼脂粉，pH=5.8上培养，25～27℃， 每天 12～14h 2000 lx的光照条件下培养，每两个星期换一次培养基分化幼苗。

1.2.3 甘蔗生根培养 选取生长旺盛大小基本一致的幼苗（高约为4～5 cm），每个组培瓶接种1～2株，设5个 G418 浓度梯度：0（CK）、10、20、30、40mg/L，每个浓度设 3 个重复。在生根培养基（CM4）：1/2 MS+4 mg/L NAA+40 g/L蔗糖+6.5 mg/L琼脂粉，pH=5.8上培养，25～27℃，每天12～14h 2000 lx的光照条件下培养，每两个星期换一次培养基生根。

2 结果与分析

2.1 G418对甘蔗愈伤组织生长的抑制作用

在CM2培养基中进行甘蔗愈伤组织培养，结果（图 1、图 2A）显示，G418浓度为 0 mg/L（CK）的愈伤组织能正常生长，愈伤活力强，基本上无褐化。当G418浓度为10 mg/L时，愈伤生长受到了抑制，部分愈伤褐化，但依然有部分材料可以成活。当G418浓度为20 mg/L时，愈伤严重褐化，无一愈伤可以成活。由此可见，甘蔗愈伤组织生长最佳的筛选浓度为20 mg/L。

图1 不同G418浓度对甘蔗愈伤生长成活率的影响

图2 不同G418浓度对甘蔗愈伤生长（A）、分化（B）及生根（C）成活率的影响

图3 不同G418浓度对甘蔗愈伤分化成活率的影响

2.2 G418对甘蔗愈伤分化的影响

在CM3培养基中进行甘蔗愈伤诱导成苗的试验，G418浓度为0 mg/L（CK）、10 mg/L、20 mg/L时，甘蔗愈伤组织均能长出苗（图2B、图3），而且试验发现G418浓度为10 mg/L、20 mg/L比0 mg/L苗生长的数量要多，速度要快，特别是G418浓度为10 mg/L。当G418浓度为30 mg/L时，在诱导成苗的初期，会看到有小苗长出来，但是在生长的后期可以发现，这些小苗最终都会死掉。在G418浓度为40 mg/L时，甘蔗愈伤均不能诱导成苗。如果筛选浓度为30 mg/L，甘蔗愈伤分化的初期，还是会有苗长出来，为了避免干扰，我们认为甘蔗愈伤分化的最佳筛选浓度40 mg/L为宜。

2.3 G418对甘蔗小苗生根的影响

图4 不同G418浓度对甘蔗生根成活率的影响

在CM4培养基中进行甘蔗生根试验，G418 浓度为 0 mg/L（CK）时，甘蔗能正常生根（图2 C、图4），根长出来的数量多，有根长出的时间明显比其他几个浓度的短，当G418浓度为10 mg/L、20 mg/L时，甘蔗可以长出根，但是需要的时间明显比CK的要长，而且长出根的数量少，根相对CK要短。在G418浓度为30 mg/L时，在初期甘蔗还有一两株绿色的小苗长出来，但是随着时间的推移，这些甘蔗苗会全部死掉。当G418浓度为40 mg/L时，甘蔗不能长绿色的小苗，也不能长出根。由此可见，甘蔗生根的最佳筛选浓度为30 mg/L。

3 结论与讨论

本研究甘蔗品种ROC22茎尖愈伤组织生长、分化、小苗生根阶段的最佳G418浓度分别为20 mg/L、40 mg/L、30 mg/L。≤20mg/L浓度的G418能促进甘蔗分化，当G418达到一定浓度甘蔗组织不能正常生长，甚至导致其死亡。因此G418可用于筛选带有其抗性的植株。

本研究结果和陈华平[5]（2005）、林美娟[6]（2006）的研究结果较接近，但是由于所用材料甘蔗品种不一样，所以也存在一定的差距。甘蔗是高度杂合的异源多倍体和多倍的非整倍体单子叶植物，遗传背景复杂，致使利用传统育种方法从有性杂交到良种育成要10～13年，周期长，成效低[16-17]。而且甘蔗转基因技术还存在转化效率低等问题。因此找到适合甘蔗高效的启动子和建立一个高效的用于遗传转化的组织培养再生体系就显得尤为重要。多倍体植物基因通常含有8～10个等位基因，给甘蔗启动子的分离造成较大的困难[7]。试验过程中发现，组培材料的大小会导致其对G418的抗性不一致，组培材料越大其对G418抗性越强。所以在试验时一定要严格控制组培材料的大小，使其大小尽量保持一致。NPTⅡ是植物遗传转化应用最广泛的选择标记基因之一，其可使植物细胞产生G418抗体。一定浓度的G418可以很好地抑制甘蔗组织生长，导致其最终死亡。所以用G418建立最优的筛选体系，为后续的甘蔗遗传转化做好准备。NPTⅡ也可产生卡那霉素的抗性，在许多双子叶植物，例如烟草上得到广泛的使用。但是单子叶植物对卡那霉素有天然的抗性，使用很高的浓度也一样会有植物体成活，还会产生白化苗。

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