甜菜基因片段的克隆及序列分析

梁 娜，伍国强，冯瑞军，刘左军，李志忠

（兰州理工大学生命科学与工程学院，兰州 730050）

肌动蛋白（Actin）广泛存在于真核生物体内各个组织细胞中[1]，是构成细胞骨架中微丝的主要成分，有维持细胞外表形态的作用，是植物体组织和个体正常生长的基础[2]。肌动蛋白与细胞的分裂、运动和信号转导等功能密切相关[3]。高等植物中Actin基因是由多基因编码的，由一个相同的基因祖先通过多轮复制进化而来，相似度极高[4]。在GenBank中，Actin基因的核苷酸序列非常保守，相似性在70%以上，甚至在有的物种之间达到了100%[5]。由于Actin基因在各种组织中表达恒定，因此常常作为比较不同来源目的基因转录水平差异的分子内标[6]。目前，人们已在霸王[6]、盐地碱蓬[7]、当归[8]、水花生[9]、蕙兰[10]等高等植物中克隆到Actin基因。

甜菜（Beta vulgaris L.）为藜科（Chenopodiaceae）甜菜属（Beta）二年生草本植物[11]，广泛分布于我国西北、华北、东北等干旱半干旱地区[12]，既具较强的抗逆性，又有很强的耐贫瘠性[12-13]，是我国的第二大糖料作物，也是新兴的可再生能源作物[14]。甜菜作为一种典型的嗜钠作物，目前已成为人们重点选择来研究抗逆基因资源的材料。然而，有关甜菜Actin基因的报道却很少见。鉴于此，本研究以甜菜幼苗根为材料，提取其总RNA，经RT-PCR扩增克隆Actin基因，为甜菜抗逆基因的表达分析提供基础。

1 材料与方法

1.1 实验材料

甜菜（Beta vulgaris L.）品种为“甘糖7号”，种子由甘肃省武威市三农种业科技有限公司馈赠。菌株E.coli DH5α购自上海生工。

1.2 实验方法

1.2.1 总RNA的提取 根据UNIQ-10柱式Trizol总RNA抽提试剂盒说明书（上海生工）提取4周龄甜菜幼苗根的总RNA。

1.2.2 引物设计与合成 参考伍国强等[6]的方法设计一对简并性引物：P1：5'-GTGGTCGTACAAC（A/T）GGTATTGTG-3'，P2：5'-GA（A/C/T）CCTCCAATCCAGACACTG-3'。 引物由上海生工合成。

1.2.3 RT-PCR扩增 根据MMLV第一链cDNA合成试剂盒操作说明书（上海生工）合成第一链cDNA。根据PCR扩增试剂盒说明书（上海生工）进行扩增。PCR扩增反应体系为50 μL，具体如下：cDNA 2 μL，10×PCR Buffer 5 μL，2 mmol/L dNTP 5 μL，25 mmol/L MgCl23 μL， 10 mmol/L P1 1 μL，10 mmol/L P2 1 μL，Taq DNA 聚合酶 （5 U/μL）0.5 μL，dH2O 32.5 μL 。 PCR 扩增反应条件为：94℃下预变性 2 min；94℃下变性 30 s、56℃下退火45 s、72℃下延伸1 min，30个循环；最后在72℃下延伸10 min，4℃下恒温放置。结束后将PCR扩增产物放置-20℃下保存，用于后续的实验。2%琼脂糖凝胶检测PCR扩增产物，根据SanPrep柱式DNA胶回收试剂盒说明书（上海生工）对目的片段进行回收和纯化。

1.2.4 阳性克隆的筛选与鉴定 将回收到的PCR产物连接至pUCm-T载体上，转化感受态细胞DH5α，在含有50 μg/mL氨苄青霉素（Amp）的LB固体培养基上进行蓝白斑筛选，质粒PCR鉴定阳性克隆后，将筛选克隆送至上海生工测序。

1.2.5 序列的生物信息学分析 测序结果在NCBI网站上进行Blast同源性搜索，使用DNAMAN生物软件对序列进行翻译和分析。

2 结果与分析

2.1 RT-PCR扩增及胶回收产物纯度鉴定

提取4周龄甜菜幼苗根总RNA，反转录得到第一链cDNA，以其为模板，使用合成好的简并性引物P1、P2进行PCR扩增。凝胶电泳检测扩增产物发现，在600 bp左右有单一的条带，与预测的目的片段的大小一致（图1），其可能是甜菜Actin基因片段。凝胶电泳检测胶回收产物，发现在600 bp左右有一条亮带，且上下无杂带，与RT-PCR结果一致，表明回收产物纯度高。

2.2 阳性克隆的鉴定

将回收纯化的目的片段连接到pUCm-T载体上，转化到E.coli DH5α。在平板上培养进行蓝白斑筛选，随机挑取若干个白斑，进行PCR鉴定，发现条带约为 600 bp处（图2），与 RT-PCR结果一致，由此说明这些克隆为阳性克隆。

2.3 测序结果及序列分析

图1 RT-PCR产物凝胶电泳图M：DNA marker，1、2：PCR 产物

图2 阳性克隆的 PCR鉴定M:DNA marker，1、2:阳性克隆

对所测得到的2个序列（图3、4）进行Blast比较发现与其他植物Actin基因的同源性在83%以上，说明我们获得的序列为甜菜Actin基因的序列。进一步对这2个序列进行比对发现它们之间的同源性为87%，表明这2个序列是Actin基因家族不同成员的序列。将其分别命名为BvACT1和BvACT2，在GenBank中注册，登录号为KF214784和 KF214785。

图3 BvACT1核苷酸序列及其编码氨基酸序列

图4 BvACT2核苷酸序列及其编码的氨基酸序列

将翻译到的甜菜Actin基因的可能氨基酸序列与NCBI中其他植物Actin基因的氨基酸序列进行多重比较分析（图5），结果发现他们的保守氨基酸均达182个，而非保守氨基酸仅有16个。这表明我们克隆的片段为Actin基因的高度保守区域。

由图 6可见，BvACT1与青葙CaACT的同源性最高可达100%、与海滨碱蓬SmACT的同源性为99%、与小花碱茅PtACT的同源性最低为92%；BvACT2与盐地碱蓬 SgACT的同源性最高可达98%，而与芝麻SiACT的同源性最低可达93%。

图5 BvACT1和BvACT2与其他植物Actin基因的氨基酸序列多重比较Actin基因的来源和GenBank登录号：CaACT1（青葙Celosia argentea,HQ844002.1），SmACT（海滨碱蓬 Suaeda maritima,FJ587488.1），PtACT（小花碱茅 Puccinellia tenuiflora,FJ545641.1），SgACT （盐地碱蓬 Suaeda glauca,EU429457.1），SiACT （芝麻 Sesamum indicum,JQ658353.1）；其中黑色代表的相似度x=100%，红色代表的相似度x（75%≤x≤99%），绿色代表的相似度x（50%≤x≤75%），白色代表的相似度x（33%≤x≤50%）

3 讨论

Actin基因编码的肌动蛋白是植物中的一类普遍存在而又非常重要的结构蛋白。大量研究表明，Actin基因作为一种看家基因在高等植物体内的保守性非常高。萼脊兰[15]、拟南芥等[16]高等植物中含有多个Actin基因。本研究利用一对简并性引物克隆得到甜菜Actin基因家族的2个成员BvACT1、BvACT2。进一步研究发现BvACT1核苷酸序列与其它植物Actin基因核苷酸序列的同源性在86%以上，而氨基酸序列的同源性则在92%以上；BvACT2核苷酸序列与其它植物Actin基因核苷酸序列的同源性在83%以上，而氨基酸序列的同源性则在93%以上。由此可见，Actin是一种高度保守的看家基因。

甜菜作为一种典型的嗜钠作物，具有较强的抗逆性，蕴藏着丰富的抗逆基因资源。而对这些抗逆基因进行深入的研究，往往需要用到内参基因。然而，在GenBank数据库中有关甜菜Actin基因序列较少。因此，本研究结果丰富了Actin基因序列的数据库，同时为甜菜抗逆基因的表达分析提供了可靠的内参基因。

图6 BvACT1和BvACT2与其他植物Actin基因的氨基酸序列同源性分析

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