低温胁迫对淡竹2个抗寒性生理指标的影响

李丽+王开芳+李自成+孙超+刘翠兰+夏阳+燕丽萍

摘 要：选择13个区域的淡竹叶片为试材，分别在0、-5、-10、-15、-20、-25℃下进行低温胁迫处理，测定其电导率和脯氨酸含量的变化，电导率结合Logistic方程计算出淡竹的半致死温度。通过脯氨酸含量分析和半致死温度的计算，综合分析不同区域淡竹抗寒性的生理生化指标，推测其抗寒性强弱：来源于烟台林科院、烟台昆嵛山、潍坊的淡竹抗寒性较强，来源于日照、沂源、东营、济南、临沂、胶南、泰安的淡竹抗寒性中等，来自浙江、江西、江苏的淡竹抗寒性最弱。

关键词：淡竹；抗寒性；相对电导率；Logistic 方程；半致死温度；脯氨酸

中图分类号：S795.701 文献标识号：A 文章编号：1001-4942（2014）11-0039-04

淡竹（Phyllostachys glauca McCl.） 又名乌竹、粉绿竹、花皮淡竹，属禾本科刚竹属植物，生长快，丰产性好，适应性强，是我国南方主要的优良绿化树种。淡竹集材用、食用、观赏、药用等众多用途于一体，是一种非常优良的中型笋材两用竹种。淡竹四季常绿，也是美化环境、调节气候、保持水土、改良生态环境的优良树种。由于淡竹良好的经济价值和生态环境效益，近年来山东省多次引种栽培。目前，山东省淡竹主要分布在沿海温暖湿润地区，现有淡竹林面积约1 300 hm2，约占全省竹林总面积80%以上，但由于缺乏系统研究和推广，淡竹在山东省还没有形成像浙江、江西等地一样的规模性效益、创造出应有的经济生态价值。影响淡竹生长的主要因素是温度和湿度，其中低温是影响我国北方地区竹类植物在园林绿化中得不到广泛推广的最重要的因子。为扩大淡竹的适宜种植范围，在人工调控温度条件下，研究了低温胁迫对其生理指标的影响。

植物抗寒性评价大多数集中在细胞膜和生理活性物质的研究。膜系统是植物受低温伤害和抵抗低温伤害的关键结构，抗寒性弱的植物，细胞膜透性增大程度较快。这种变化大多出现在形态变化之前，因而质膜的透性变化可显示细胞膜结构和功能的受损程度。用电导仪测定细胞外渗液电导率即相对电导率变化，是用来反映细胞膜伤害程度和大小的一个重要指标。目前，采用电导法结合Logistic 方程在植物抗寒性研究中的报道较多[1]。徐传保等[2]采用电导法测定了竹子的抗寒性，与实际观测基本一致。脯氨酸的含量也是用来反映抗寒性的主要指标，Delauney等[3]认为，脯氨酸在植物抗寒中作为渗透调节物质起作用；Rajendrakumar等[4]研究发现，脯氨酸在植物的抗寒作用中主要保护蛋白质，维持其最基本的生理功能；Anjum等[5]认为，脯氨酸在低温条件下主要作为活性氧清除剂，保护细胞膜不受破坏；还有研究认为，脯氨酸作为能源物质在抵御寒冷胁迫中发挥作用[6]。本试验研究了低温胁迫对淡竹叶片电解质外渗率和脯氨酸含量的影响，探讨淡竹耐寒性的生理机制，提出其忍受的临界低温，旨在为淡竹的抗寒性筛选、育种、栽培和引种推广提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料

供试淡竹来源于日照、沂源、东营、济南、潍坊、临沂、胶南、泰安、烟台昆嵛山、江西、浙江、江苏及烟台林业科学研究院，栽植在山东省林业科学研究院济南试验苗圃竹子引种基地。该地位于北纬36°02′～37°31′，东经116°11′～117°44′，四季分明，气候温和，年平均气温为14.9℃，极端最低气温-22.5℃，年降水量665.7 mm。试验地土壤为褐土，pH 7.1，中等偏下肥力水平。

1.2 试验方法

1.2.1 低温处理 参照徐传保等[2] 的方法。于2013年12月3日上午8∶ 00～9∶ 00 分别在健壮植株中部枝条取叶，叶片采后用湿纱布包裹，带回实验室。用自来水冲洗后，再用蒸馏水冲洗4～5次然后用吸水纸吸干水分。将每个材料的叶片分成6份，其中一份为对照，其余每份置于超低温调控冰箱进行低温处理，处理温度梯度为 0、-5、-10、-15、-20、-25℃， 降温速度为5℃/h，到达设定的目的温度时维持12 h。处理后的样品置于4℃冰箱解冻12 h 后测定各项指标。

1.2.2 相对电导率的测定 将待测叶片除去中脉，剪成3 mm×3 mm 的小片，将不同的叶片充分混合后，称取0.2 g，倒入试管中，再加20 mL双蒸馏水，用盖子盖紧，在20～30℃ 条件下振荡1 h，用电导仪测定初电导值（S1 ）。再将各样品置沸水中煮沸10 min， 取出冷却，在室温下平衡10 min，摇匀， 测其终电导值（S2 ）， 以不加叶片的双蒸馏水作空白测定（S0）。每个处理重复3 次，取平均值。 根据L（%）= （S1-S0）/（S2-S0 ） ×100 ， 计算相对电导率。

1.2.3 游离脯氨酸（Pro）含量测定 采用酸性茚三酮方法测定[7]。称取不同处理混匀的叶片0.5 g，分别置于带塞的试管中，每个处理重复3 次，取平均值。从标准方程中求出提取液中脯氨酸含量，按照公式计算出叶片脯氨酸含量。

脯氨酸含量（mg/g）=[提取液中脯氨酸质量（mg）×提取液总体积（mL）×1000]/[测定时所吸取提取液的总体积（mL）×样品质量（g）]。

1.3 数据处理

采用DPS 软件将温度（t） 和相对电导率（y） 用Logistic方程y=k/（1+ae-bt）进行拟合，求出相对电导率的拐点温度，即为低温半致死温度（LT50）[8]。用单因素方差分析处理组间的差异。

2 结果与分析

2.1 不同低温胁迫对相对电导率的影响

由表1可见，随着温度降低，不同来源淡竹的相对电导率均出现不同程度的增加。来源于江西、浙江和江苏的淡竹在温度达-15℃ 时相对电导率急剧上升， 分别比-10℃ 时增加98%、130%和98%，而来自山东日照、沂源、东营、济南、潍坊、临沂、胶南和泰安的淡竹则在温度到达-20℃时相对电导率才出现急剧上升，增幅达60%以上，当温度下降到-25℃时， 烟台昆嵛山淡竹相对电导率达到61.96%，而烟台林科院新种质淡竹依然保持平稳的相对电导率， 只有47.87%。可见，烟台林科院淡竹耐寒性最强，其次是烟台昆嵛山淡竹，来自江西 、浙江和江苏的淡竹耐寒性最差。测定结果作方差分析，不同区域间淡竹和温度处理间相对电导率差异达5%显著水平，可见不同区域之间随着温度的降低耐寒性表现出很大的差别。区域间多重比较结果显示，耐寒性之间的差异主要表现在烟台林科院淡竹和江西淡竹、浙江淡竹、江苏淡竹及其它区域之间（表略）。endprint

Logistic方程是一个典型的“S”曲线方程，淡竹叶片相对电导率随温度的变化呈“S”型曲线，利用相对电导率拟合Logistic方程求出植物组织的低温半致死温度（LT50），见表1。结果表明，不同来源的淡竹抗寒性有一定的差异，LT50越高，抗寒性越弱，LT50越低，抗寒性越强。从半致死温度所反映的淡竹耐寒性强弱来看，烟台林科院淡竹半致死临界温度为-26.78℃，耐寒性最强，烟台昆嵛山淡竹半致死临界温度为-23.86℃，耐寒性较强，浙江淡竹半致死临界温度为-15.76℃，耐寒性最弱，其次江西淡竹半致死临界温度为-16.18℃，耐寒性较弱。

2.2 低温胁迫对淡竹叶片游离脯氨酸含量的影响

由图1可见，0℃时供试的13个区域淡竹叶片的游离脯氨酸含量无明显差异，随着温度的降低，游离脯氨酸的含量开始升高，当温度降至-10℃时，除烟台林科院淡竹外，其它淡竹叶片游离脯氨酸含量均上升到最大值，济南淡竹叶片游离脯氨酸含量最高为1.24 mg/g，其次是潍坊和烟台昆嵛山淡竹，分别为1.13 mg/g 和1.12 mg/g。当温度降至-15℃时，烟台林科院淡竹叶片游离脯氨酸含量达到最大值1.52 mg/g，其余淡竹叶片游离脯氨酸含量下降为最小值。随着温度继续降低，游离脯氨酸含量均继续回升，当温度达到-25℃时，所有淡竹的游离脯氨酸含量较0℃时均有所增加，增幅较大的是来自烟台林科院、潍坊、日照、东营、胶南、沂源和烟台昆嵛山的淡竹；增幅较小的是来自江西、浙江和江苏的淡竹。对不同处理温度下的淡竹叶片游离脯氨酸含量进行方差分析，结果表明， Sig.=0.018<0.05，且FA=6.727>F0.05=1.195，不同温度处理间淡竹叶片游离脯氨酸含量差异显著； Sig.=0.000<0.01，且FB=18.991>F0.01=4.219，不同区域间淡竹叶片游离脯氨酸含量差异极显著。烟台林科院淡竹叶片游离脯氨酸含量平均值最大，其次是潍坊和烟台昆嵛山淡竹；江西淡竹和浙江淡竹最小，来自日照、沂源、济南、东营、潍坊、胶南、泰安、烟台昆嵛山、临沂的淡竹叶片游离脯氨酸含量平均值间差异不显著，但显著低于烟台林科院淡竹 （表略）。

3 结论与讨论

目前，竹类植物抗寒性的调查局限于外观形态的研究，要想真正了解不同区域淡竹的生长极限温度，确定其适宜生长范围，还必须从抗寒生理机理内部因素进行研究。低温引起细胞膜透性发生变化，是植物低温伤害的一个重要原因[5]。生物膜结构的变化是研究抗寒机理的重要问题，膜的性质、结构和相变是寒害原初反应的重要指标，而在遗传基因控制范围内，膜脂成分的不饱和度以及细胞质黏度和流动性可作为抗寒性强弱的重要生理指标[9]。一般膜透性与抗寒性的关系可通过植物低温处理后的电解质渗出率来反映，也是目前研究测定植物抗寒性的最常用的试验方法。进行细胞膜透性和抗寒性的关系研究以及其动态变化，可以从细胞膜方面揭示竹类植物抗寒性的机理[10，11]。徐传保等[12]采用电解质外渗率评价4种淡竹的抗寒性，结果表明，4种竹子抗寒性的强弱顺序与形态观察结果完全一致，采用电解质外渗率评价竹子抗寒性结果较稳定。本试验中，在0℃至-15℃温度胁迫下淡竹叶片的相对电导率变化比较平缓，在-25℃低温胁迫下急剧上升，表明胁迫温度越低，细胞受伤害越重。这与黄程前等[13]报道的低温胁迫20种观赏丛生竹的抗寒性测定结果一致，张志[14]在温度胁迫早熟禾的研究中也得到相同的结果。王永红等[15]研究结果表明电解质外渗率与低温胁迫山茶叶片褐变所表现的规律较吻合，证明电解质外渗率反映山茶物种耐寒性强弱较为客观真实。上述诸多研究结果说明，电解质外渗率可以作为判断植物抗寒力强弱的重要指标。在低温胁迫下，相对电导率与温度之间的关系曲线，能较好地用Logistic曲线方程y=k/（1+ae-bt）进行拟合，计算出不同区域淡竹的半致死温度。从半致死温度来看，本试验13个区域淡竹的抗寒性强弱顺序为：烟台林科院>烟台昆嵛山>潍坊>临沂>日照>胶南>东营>济南>泰安>沂源>江苏>江西>浙江。

游离脯氨酸作为渗透调节物质，大多数研究证明其含量和植物抗寒性有很大的相关性，其含量在植物可忍受的低温胁迫下，呈现出上升的趋势[16]。李建设等[17]发现茄子幼苗脯氨酸含量的增加幅度与品种的抗寒性强弱存在密切相关性。杨静等[18]在研究低温胁迫对 1年生红叶石楠品种鲁宾斯（Photinia glabra var. Rubens）盆栽扦插苗叶片组织生理生化特性的影响时发现，随着胁迫温度降低和胁迫时间的延长，脯氨酸含量增加。从本试验结果来看，通过不同低温胁迫处理后，不同区域淡竹叶片中的游离脯氨酸含量差异较大，游离脯氨酸含量达到最大值的时间也不同。除烟台林科院淡竹叶片中游离脯氨酸含量最大值1.52 mg/g出现在-15℃外，其余所有淡竹叶片中游离脯氨酸含量最大值出现在-10℃。当温度达到-25℃时，所有竹子的游离脯氨酸含量较0℃时均有所增加，增幅较大的为烟台林科院淡竹、潍坊淡竹；增幅较小的为江西淡竹、浙江淡竹和江苏淡竹。同时研究结果表明，抗寒性强的烟台林科院淡竹叶片中游离脯氨酸含量高于抗寒性弱的江西淡竹，该研究结果与自然界分布的各物种所表现的抗寒性强弱基本相一致，在实践中对引种与生产有一定的指导意义。

参 考 文 献：

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