硝酸还原酶活性响应的物种特异性

赵念席， 沈广爽， 石雪芹

(南开大学 生命科学学院，天津300071)

0 引 言

硝酸还原酶(Nitrate Reductase，NR)是高等植物氮代谢的关键酶。植物的氮源主要是无机氮化物，而无机氮化物中又以铵盐和硝酸盐为主，约占土壤含氮量的1% ～2%，植物吸收铵盐后可直接用于氨基酸的合成，而如果吸收了硝酸盐，则必须通过NR 进行代谢还原才能被植物利用［1］。另一方面，因为NR 与植物吸收利用氮肥有关，对农作物产量和品质有重要影响，因而NR 活性被当作植物营养或农田施肥的指标之一，也可作为品种选育的指标之一，因此关于NR 活性影响的研究也具有重要的实际应用价值［2-4］。

基于NR 的重要性，多数高校会在本科植物生物学实验中安排NR 活性测定，其中，实验中一般都会重点强调NR 是一种诱导酶，通常在有NO－3存在时，会诱导NR 的活性，且光照能提高NR 活性。因此，在准备实验材料过程中，注重KNO3诱导过程和光照过程。但我们多年实验经验证明:有许多植物材料经诱导也很难检测到NR 活性，还有一些材料非诱导对照组和诱导组NR 活性无显著差别。因而，寻找并确定好的本科实验材料成为本科实验教学工作的一个关键点［5-6］，如果选不对实验材料会使整个实验失败，学生则不能准确掌握知识点。然而，随着科学的发展和技术的进步，关于NR 活性调节的可能机制已经被广泛研究。结果表明:除受到NO－3 底物浓度、光，以及培养环境因子等方面的影响外［7-9］;在植物N 代谢中，NH+4浓度对NR 活性也有影响，且对不同植物的影响方式并不一致［10-12］，但关于遗传因素对NR 活性的影响涉及较少，从而使得本科教学中将NR 活性的大小和诱导响应作为一个普遍规律来讲解，其实作为物种选育的指标之一，NR 应该会具有物种特异性和品系特异性。因此，对植物NR 活性的特异性的了解不仅对提高农业施肥效率等方面具有重要作用，对学生探究其原因也具有兴趣引导的作用。

随着高校综合性实验的逐渐推进，以培养学生的创新思维习惯，提高分析问题和解决问题的能力为出发点，我们在试验教学改革中设置综合实验，检测了不同植物硝酸还原酶对KNO3诱导的敏感性问题，并进一步检测了两种N 源对其中3 种植物硝酸还原酶诱导敏感性的影响。

1 材料与方法

1.1 材 料

本文选择小麦(Triticum aestivum)、玉米(Zea mays)、辣 椒(Capsicum annuum)、白 菜(Beassica pekinensis)、萝卜(Raphanus sativus)、番茄(Lycopersicon esculintum)、油菜(Brassica campestris)作为本研究所用的实验材料。

1.2 幼苗移栽和无土栽培

种子发芽3 ～4 周后，将这些植物幼苗移栽至1 L培养缸中1 ×Hoagland(缺N 素)营养液培养，每种植物6 盆，其中3 盆用于NR 的诱导，另外3 盆作为对照，分别作好标记。

1.3 KNO3 对植物硝酸还原酶的诱导

3 d 后，在9:00 ～10:00 中向诱导组处理溶液中加入6 mL 1 mol/L KNO3溶液，而向对照组中加入6 mL蒸馏水，放置在人工光源400 μmol/(m2·s)下光照培养，诱导硝酸还原酶活性。2 d 后14:00 ～16:00(选择此时间段是希望与学生上课时间同步)，用于硝酸还原酶活性的测定。

1.4 硝酸还原酶活性的测定

试剂配置参考高玉葆等［2］略作修改，其中磺胺和萘基乙烯胺溶液参考刘亚丽等［13］配置。

每种植物材料在不同处理条件下采集样品3 份，采用离体法测定NR 活性。具体方法为:

(1)每组处理样品分别随机选取均匀植物叶片3份，每份0.5 g，于研钵中剪碎置低温冰箱冰冻30 min，取出置于冰浴中并加少量石英砂及4 mL 提取缓冲液，研磨成匀浆，转移入离心管中，在4 ℃8 000 r/min 离心5 min，上清液即为粗酶提取液。

(2)从每份粗酶液中吸取2 个1 mL，其中一份加入0.1 mol/L KNO3磷酸缓冲液和NADH 溶液(0. 1 mol/L pH7.5 磷酸缓冲液溶液配制)，进行酶反应;另一份加入0.1 mol/L KNO3磷酸缓冲液和0.1 mol/L pH7.5 磷酸缓冲液溶液而不加入外源的NADH，作为参比。所有溶液混匀，在25 ℃保温30 min。

(3)保温结束后立即加入1 mL 1% 磺胺溶液终止酶反应，再加1 mL 0.2%萘基乙烯胺溶液，黑暗中显色30 min 后(此次保温时间与标准曲线测定时的保温时间需严格一致)，过滤，以参比管为空白参比，测定酶反应组滤色在540 nm 的光密度。

1.5 不同N 源对硝酸还原酶诱导活性的影响

对番茄、辣椒和小麦实施不同的N 素培养，营养液在1 ×Hoagland 营养液的基础上略作修改，其中包括以(NH4)2SO4作为N 源和以KNO3作为N 源2 种培养液，分别记作-N 和-N，每种植物在每种培养液下培养6 盆，其中3 盆用于硝酸还原酶的诱导，另外3 盆作为对照，分别作好标记，每种植物共培养12 盆，3 种植物共36 盆。3 d 后，实施1.3 节和1.4 节内容。

1.6 数据处理

将所得数据输入Excel，借助SPSS 中的方差分析对数据进行分析。

2 结果与分析

2.1 不同植物材料NR 活性的差异

对缺N 营养液中的植物材料进行硝酸还原酶的诱导，结果表明各材料间NR 活性有显著差异。其中，除番茄外，其余6 中植物均诱导测得NR 活性;但是在这6 种测得NR 活性的植物材料中，仅有辣椒在未诱导组未检测到活性，而其他5 种植物中均检测到很高的NR 活性;活性大小方面6 种植物都很好，对于本科实验来讲都还比较合适(见表1)。

表1 不同植物硝酸还原酶活性的差异

2.2 不同N 源对硝酸还原酶诱导活性的影响

选择有代表性且在本科实验教学中经常使用的小麦、辣椒和番茄为实验材料，研究不同N 源对NR 活性的影响。结果表明:2 种N 源对3 种植物KNO3诱导敏感性的影响具有物种特异性。对于番茄，在NH+4-N培养条件下，添加KNO3诱导能检测到微弱的NR 活性，其他3种培养条件均未检测到NR活性;对于辣椒来讲，4 种处理均检测到NR 活性，但在培养条件下，添加KNO3诱导对NR 活性无显著提高，而-N 培养条件下，KNO3诱导能显著提高NR 活性;对于小麦来讲，4 种处理均检测到NR 活性，培养-N 条件下，对照组检测到很低的NR 活性，添加KNO3诱 导 能 显 著 提 高 NR 活 性(达 8. 68 μg/(g·h));-N 培养条件下，未诱导组和添加KNO3诱导处理所得NR 活性接近，表明KNO3添加对在-N 培养的小麦NR 不能起到诱导作用。

表2 不同培养条件对番茄、辣椒和小麦硝酸还原酶活性诱导的差异

3 讨 论

本研究结果证明:在诱导环境相对适宜并相同的情况下，物种的差异(即遗传因素)对NR 诱导活性且决定性作用。本研究中辣椒(Capsicum annuum)在无KNO3的添加的对照组中未检测到NR 活性，而在KNO3的添加的诱导组中检测到很好的活性，从某种程度上能证明NO－3的诱导作用;此外，小麦(Triticum aestivum)，大白菜(Beassica pekinensis)，萝卜(Raphanus sativus)，玉米(Zea mays)，油菜(Brassica campestris)在无KNO3添加的对照组中，仍能检测出很高的NR 活性，表明NR 诱导中的作用不在于(至少不完全在于)通过影响KNO3的吸收，即已经存在NR 活性的植物，在一定的环境条件下，即使无KNO3的添加也能维持其活性［14］。但本研究中多数物种在添加KNO3的诱导组，NR 活性显著提高(见表1)。随着科学研究的进行，NR 作为诱导酶的定义(植物本身不含有，只有外加NO－

3 才能诱导生成)也需要通过正式的教科书进行修订。其实，林建明等［14］就对NR 的诱导机理提出过有两种情况:①酶蛋白的重新合成(植物本身不含有，只有外加NO－3，才能诱导生成);②酶前体的活化(说明不一定需要外加NO－3，才能诱导生成)。另外，番茄在对照组和诱导组均未检测到NR 活性，在其他研究中也有类似的实验结果，如陶懿伟等［6］实验中紫藤等6 种植物未检测到NR 活性，随着科学的进步，相关机制会逐步清晰。

本研究结果证明:不同形态的氮素对植物体内的NR 活性有不同的影响，可能表现为促进、抑制或者无显著影响，在相同的培养环境中，主要体现在物种水平上的差异。在本研究中有如下几种情况:

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