聚合酶链反应-酶联免疫法筛选孢子丝菌特异性探针

孙 田, 刘晓明, 张振颖

孢子丝菌病在世界范围内广泛分布[1]，国内各地均有本病的报道[2]。本病诊断目前主要依靠临床表现及病原菌的分子生物学鉴定。孢子丝菌的相对特异性探针[3-5]为孢子丝菌病的分子生物学诊断奠定了基础，但尚无资料对各探针进行系统地比较。本研究旨在用聚合酶链反应-酶联免疫（PCR-ELISA）的方法在现有报道的探针种类中筛选出结合效率较高的孢子丝菌特异性探针，为快速、准确的诊断孢子丝菌病提供临床参考。

1 材料和方法

1.1 菌株来源

来自不同地区和不同临床分型孢子丝菌病的申克孢子丝菌50 株，其中大连37 株，上海5 株，北京4 株，长春2 株，南京1 株，美国标准培养标本(American type culture collection) 保存菌株ATCC10268 1 株（表1）。念珠菌、毛霉、烟曲霉各1 株，均为大连医科大学附属第一医院皮肤科真菌室保存菌种。

1.2 实验方法

1.2.1 试剂 基因组DNA 提取液CTAB [2%(W:V)十六烷基三甲基溴化物，100 mmol/L Tris-HCl，1.4 mol/L NaCl，20 mmol/L EDTA]，LA Taq 酶（5U/μl）购自大连宝生物工程有限公司，PCR-ELISA 试剂盒购自德国Roche 公司。

表1 50株孢子丝菌菌株的来源及临床类型

1.2.2 基因组DNA 提取 将所有临床分离株接种于SDA 液体培养基28℃培养2 周，采用Graham 等[6]的CTAB 法提取真菌基因组DNA，并用紫外分光光度计检测DNA 含量。

1.2.3 PCR 扩增目的片段 以真菌通用引物NS1(18SrDNA 的部分碱基) 作为引物1 (5'-GTAGTC ATATGCTTGTCTC-3')，参照GeneBank 中5 株孢子丝菌核糖体保守区28SrDNA 3'端的基因序列设计引物2（5'-TTGGTCCGTGTTTCAAGACG-3'）；PCR 反 应体 系：10×buffer 5 μl，dNTPs 4 μl，Taq 酶0.25 μl，各 菌 株DNA 1 μl(约70 ng)，引 物 各1 μl，dd H2O 37.75 μl；循环条件：96℃预变性1 min；95℃ 40's，52℃ 1 min，72 ℃ 2 min 扩增30 个循环；最后一个循环后于72 ℃延伸7 min。产物鉴定：取5 μl 产物于1%琼脂糖凝胶电泳，并取适量产物送至上海生物工程有限公司进行纯化测序，将测序结果在基因库网上查询，并用Clustal 软件比较分析，扩增出编码核糖体（18S、5.8S、28SrRNA）及其内转录间隔区（ITS1、ITS2）的基因片段（图1）。

图1 引物和探针杂交位点示意图

1.2.4 PCR-ELISA 合成一段以扩增PCR 产物片段内ITS3 基因为靶向的探针，并以生物素标记，利用此探针结合上述DNA 片段使其固定在包被亲和素的 96 孔板上（DNA 片段-探针*生物素---亲和素-96 孔板），分别加入5 个地高辛标记的探针进行杂交，以底物显色者记为阳性，记录显色与否、显色强弱及酶标仪读取的吸光度（图2）[3]。可供筛选的孢子丝菌特异性探针序列[3,5,6]分别为针对28SrRNA 的 U26852：5'-Digoxigenin CGGACCACCCGGCG-3'；U26866：5'-Digoxigenin CGGCGGCATGCCCC-3'；U26866'：5'-Digoxigenin GTGGTCCGCGAGGCGCAA-3'；针 对18SrRNA 的M85053：5'-Digoxigenin GCGCTGCCAAAGCAACGC-3'；针对ITS2 区的AF117945：5'-Digoxigenin GACGCGCAGCTCTTTTTA-3'。用于与包被亲和素的96 孔板结合的探针序列[3]为：ITS3-B：5'-Biotin GCATCGATGAAGAACGCAGC-3'，合成于大连宝生物工程有限公司。杂交过程按PCR-ELISA 试剂盒说明书进行。每孔读取405 nm 波长下的吸光度（参考波长为492 nm），每两个平行样品的吸光度（A）值取平均数。A 值的修正：EI=A（待测DNA）/A（H2O）。

1.3 统计学方法

采用SPSS17.0 统计软件对数据进行分析，各种探针的EI 值用均数±标准差表示，组间总的比较采用单因素方差分析，两两比较采用q 检验（LSD 法），P ＜0.05 为差异有统计学意义。

图2 PCR-ELISA原理示意图

2 结果

2.1 PCR 产物的鉴定

以真菌通用引物NS1 和笔者自行设计的引物2对50 株孢子丝菌菌株进行扩增，均扩增出编码核糖体（18S、5.8S、28SrRNA）及其内转录间隔区（ITS1、ITS2）的基因片段约3 000 bp（图3）。经序列测定和比较，5 个待筛选探针及ITS3 探针的碱基序列均位于该DNA 片段上。

图3 50株孢子丝菌18SrDNA-28SrDNA的PCR片段凝胶电泳图

2.2 探针的结合效率检测结果

在相同的杂交和ELISA 条件下，以ATCC10268为阳性对照，毛霉、烟曲霉、念珠菌各1 株为阴性对照，双蒸灭菌水为空白对照，50 株孢子丝菌均对探针U26852 显色较强，对其他4 个探针则显色较弱。统计结果显示，U26852 的EI=15.29±3.88，U26866 的EI=1.36±0.21，AF117945 的EI=1.12 ±0.12， M85053的EI=1.13 ±0.13， U26866'的EI=1.42±0.22，各组间总的比较差异有统计学意义（F=650.317，P ＜0.05），组间两两比较显示，U26852 的EI 值与其他4 个探针比较，差异均有统计学意义；其余各组间比较，差异均无统计学意义。毛霉、烟曲霉、念珠菌对5 个探针EI 值均偏低（0.97 ～1.02），双蒸灭菌水为1。

3 讨论

孢子丝菌的基因组DNA 由30 万左右个碱基组成，确定各部位的功能已经成为未来研究的方向和目标。国内外在基因诊断方面，目前侧重于比较多种致病性真菌间的差异而寻找单一的探针和引物。由于真菌核糖体DNA（rDNA）基因的部分区域在进化上高 度保守，而在其他区域又存在着足够的变异，因此利用rDNA 基因进行探针的设计成为当前研究的热点。Sandhu 和 Lindskey 等[3,4]通过与其他深部真菌和浅部真菌及细菌进行对比，设计出针对18srRNA、28s rRNA、ITS2 区的孢子丝菌相对特异性探针，为孢子丝菌病的分子生物学诊断奠定了坚实的基础。本研究首次对已报道的多种孢子丝菌特异性探针进行筛选，以得到结合效率较高的探针。

1992 年Sano 等[7]首次报道了免疫PCR 技术，该方法将血清学中的抗原抗体反应，与聚合酶链反应特异扩增一段DNA 分子的技术结合起来，用一段具体的DNA 分子标记抗体去检测抗原，PCR 扩增此段DNA 分子，电泳定性，根据此段DNA 分子是否存在，来显示抗原是否存在[8]。

Lindsley 等[3]将免疫PCR 方法进行了改良，利用生物素与亲和素之间强大的特异性结合原理，将PCR 产物借助生物素标记的该片段探针结合到包被亲和素的96 孔板上，同时加入地高辛抗原标记的特异性探针进行杂交，反应洗板后加入酶标记的地高辛抗体和显色底物，通过显色强弱和酶标仪测定吸光度值，成功地用特异性寡核酸探针快速鉴定了9 种双相型和酵母样真菌病原体。Elie 等和Fujita 等[9,10]通过免疫PCR 的方法应用种特异性探针快速鉴定了念珠菌属的部分菌种。朱利平等[11]用微孔板双探针杂交法快速鉴别了都柏林念珠菌和白念珠菌。该方法具有PCR 和生物素-亲和素双重放大系统，具有较高的结合效率。PCR-ELISA 技术以其快速、灵敏、特异、可批量检测的优点，现已被广泛的应用于转基因食品、病原微生物的检测中，并取得了很大的成果[12]。

我们采用Lindsley 等[3]改良后的PCR-ELISA 方法，以50 株孢子丝菌菌株为样本进行5 个特异性探针的筛试。实验过程中笔者发现，对于探针U26852，在一定浓度范围内，EI 值不随待筛选探针的浓度增大而增大，而随PCR 产物浓度的增大而增大。我们扩增得到的PCR 产物浓度为16 ～30 ng/μl，EI 值8.54 ～24.11。其他4 个探针均结合效率较差且样本之间差异无统计学意义，而进一步测序时发现5 个探针与标准株核糖体基因序列均具很好的同源性。由此笔者认为PCR 产物与探针的DNA 空间构象可能影响二者结合，仅凭显色强弱来确定探针的结合效率尚存一定缺陷。基于此，我们着手对5 个探针杂交靶位的32 株孢子丝菌临床分离株（不同基因型别）核糖体基因序列进行测定，以期通过比较探针与靶位同源性的高低来解释探针敏感性差异的原因。结果发现32 株菌株的探针杂交靶位核糖体基因序列并无差异，故该现象的产生原因有待进一步探讨。本方法仍停留在培养基菌落的DNA 提取和扩增，未能进行临床标本的直接检测，故其实用价值有待进一步提高。

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