杜仲皮不同萃取部位抗氧化活性研究

2014-12-23彭胜王志宏郑阳史丽娟赵帅唐坤海彭密军

应用化工 2014年9期

彭胜，王志宏，郑阳，史丽娟，赵帅，唐坤海，彭密军

(吉首大学林产化工工程湖南省重点实验室杜仲湖南省工程实验室，湖南张家界 427000)

杜仲(Eucommia ulmoides Oliv.)为我国特有名贵滋补中药材，其皮入药已有两千多年历史，早在汉代《神农本草经》中就被列为“上品”，具有“三降六抗一增”等作用［1］。抗氧化成分如黄酮、多酚类化合物是杜仲的主要活性物质，它们通过清除体内自由基、还原氧化物质，达到延缓衰老、提高机体免疫力等效果［2-4］。目前杜仲皮提取物各萃取部位的抗氧化活性尚无报道。本实验对杜仲皮不同萃取部位的体外清除·OH 和·DPPH 活性进行研究，以期为杜仲皮的进一步开发利用提供理论依据。

1 实验部分

1.1 材料与仪器

杜仲皮2012 年5 月于吉首大学张家界校区后山采摘(经廖博儒研究员鉴定为杜仲)，50 ℃烘干，粉碎并过40 目筛，备用;1，1-二苯基-2-苦苯肼自由基(·DPPH);无水乙醇、石油醚、三氯甲烷、乙酸乙酯、正丁醇、盐酸、硫酸亚铁、过氧化氢、三羟甲基氨基甲烷(Tris)、邻二氮菲等均为分析纯;所有用水为超纯水。

U-3900 紫外可见分光光度计;KQ-250E 超声波清洗器;Hei-VAP 旋转蒸发仪;BM400 数显电热恒温水浴锅;AEG-220 电子天平。

1.2 实验方法

1.2. 1 杜仲皮不同萃取物的制备准确称取1 000 g杜仲样品以料液比1∶15 加入60%乙醇水溶液超声辅助提取40 min，滤渣以1∶10 料液比重复提取1 次，合并滤液并浓缩至1 000 mL，依次用1 000 mL石油醚、三氯甲烷、乙酸乙酯、正丁醇萃取，各萃取相和萃余相分别于55 ℃浓缩成浸膏，冷冻干燥得石油醚萃取物0. 947 8 g，三氯甲烷萃取物2.978 5 g，乙酸乙酯萃取物6.909 0 g，正丁醇萃取物15.232 0 g，萃余相物质100.737 0 g。

1.2.2 杜仲皮不同萃取物清除·OH 活性测定采用邻二氮菲-Fe2+-H2O2法［5］，按表1 数据分别加入试剂后，定容至10 mL，混合均匀，于37 ℃水浴中反应1 h，紫外可见分光光度计上510 nm 处测定吸光值(3 个平行)，计算杜仲皮不同萃取物对·OH的清除率，见下式。

式中 A0——空白参比吸光值;

A1——未损伤管吸光值;

A2——损伤管吸光值;

A3——样品参比吸光值;

A4——样品管吸光值。

表1 邻二氮菲-Fe2+-H2O2 反应体系加样表Table 1 Protocol of phenanthroline-Fe2+-H2O2 reaction system mL

1.2.3 杜仲萃取物清除·DPPH 活性测定［5］精密称取1，1-二苯基-2-苦苯肼自由基，用无水乙醇溶解并配制成0.20 mmol/L 溶液。按表2 分别加入试剂和样品后，25 ℃水浴中保温30 min，以无水乙醇为对照，在紫外可见分光光度计上514 nm 测定吸光值，计算杜仲皮不同萃取物对·DPPH 的清除率，见下式。

表2 清除·DPPH 加样表Table 2 Protocol of scavenging·DPPH

2 结果与讨论

2.1 杜仲萃取物清除·OH 活性测定

自由基是体内进行物质代谢时产生的，高化学活性的自由基氧化不饱和脂肪酸，导致细胞功能突变或衰退，从而引起老化和一系列病变及多种疾病。杜仲皮中含有丰富的抗氧化物质，这些物质通过清除机体内自由基，还原氧化物质，从而达到保护机体，延缓衰老的作用。

图1 杜仲皮不同萃取物清除·OH 活性Fig.1 Scavenging activity of different solvent fractions from the bark of Eucommia ulmoides Oliv. on·OH

图2 Vc 清除·OH 活性Fig.2 Scavenging activity of Vc on·OH

由图1、图2 可知，在0.5 ～300 μg/mL 质量浓度范围内，杜仲不同萃取物随着质量浓度的增加，对·OH的清除率先升高后降低。萃取物中清除活性最高的是正丁醇相，当其质量浓度为190 μg/mL 时清除率达到75.23%，与抗坏血酸最大清除率很接近;乙酸乙酯相清除作用次之，当质量浓度为230 μg/mL时，清除率为68.84%;氯仿相清除率稍低，清除率为50.01%;石油醚相和萃余相清除率最低，均低于20%。可能是由于不同极性溶剂萃取物的活性成分不同，其清除·OH 的能力不同。

2.2 杜仲皮不同萃取物清除·DPPH 活性测定

在细胞进行代谢的过程中，自由基作为副产物源源不断的产生，少量自由基对人体有益，过量则会破坏细胞结构，导致细胞功能丧失，造成机体损害。·DPPH 是一种有机自由基，可用其测定抗氧化物质打断脂质氧化或蛋白质氧化的链锁反应的能力。抗氧化物质清除·DPPH 反应原理为·DPPH 溶于乙醇等有机溶剂中且呈紫色，性质稳定，抗氧化剂的供氢离能力使得·DPPH 的孤对电子被配对而使其褪色，514 nm 处测得的特征吸收峰吸光值变小［6］。

由图3、图4 可知，杜仲皮不同萃取物质量浓度和清除· DPPH 活性存在量效关系。在0 ～120 μg/mL质量浓度范围内，·DPPH 清除率随着萃取物质量浓度的增大而增大，当质量浓度为120 μg/mL时，清除·DPPH 效果依次为乙酸乙酯相＞正丁醇相＞氯仿相＞萃余相＞石油醚相，最大清除率高达93.01%，可能原因在于以上萃取溶剂对于多酚类化合物等抗氧化成分萃取能力依次降低。