长白山药用真菌鸡爪苓菌丝体全长cDNA文库的初步构建

廖鏖，栾换东，李太元，李艳茹，许广波(延边大学农学院，吉林延吉133002)

鸡爪苓是我国长白山区特有的野生猪苓(Polyponus umbellatus(Pers.)Fr)种属，其菌核体形细长，分枝较多，表面多褶皱，形如鸡爪［1－4］。XING 等［5］通过对产自不同地区猪苓菌核的nrDNA ITS和28S rRNA(LSU)序列进行比对分析后，提出鸡爪苓与陕西等地所产猪苓的种内遗传背景不同，应列为单独类群。猪苓菌核是由大量菌丝体相互缠绕组成的休眠体，也是其药用部位，具有利尿渗湿、免疫调节、抗肿瘤的作用［6－9］。目前，国内针对猪苓的研究主要集中于化学活性物质的分离纯化、药理活性的测定和遗传分类等方面，有关猪苓分子生物学方面的研究较少，刘开辉等［10］通过rDNA，ITS(1，2)序列分析研究了不同地区猪苓的亲缘关系，宋超等［11］克隆猪苓拟核cDNA，得到溶血素全长cDNA。

cDNA文库即生物在某个发育时期内所转录的全部mRNA经反转录形成的cDNA片段与载体连接而形成的包含全部mRNA信息的cDNA克隆集合［12］，主要包括全长cDNA文库、均一化cDNA文库和消减cDNA文库。全长cDNA文库的构建、测序和功能注释是了解生物体结构和功能的重要方法［13］。笔者采用SMART技术，MMLV－RT反转录酶作用微量总RNA，快速构建了鸡爪苓菌丝体全长cDNA文库，为研究鸡爪苓生长分化的分子机制提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料 鸡爪苓菌丝体由采自长白山区野生鸡爪苓菌核经组织分离后得到，菌株经纯化后保存于延边大学微生物学与免疫学教学实验中心。

Trizol reagent购于Invitrogen公司，SMARTTMcDNA Library Construction Kit User Manual，Advantage 2 PCR Kit购于clontech公司，MaxPlaxTMLambda Packaging Extracts购于Epicentre公司。

1.2 方法

1.2.1 鸡爪苓菌丝体总RNA的提取。取经纯培养7、14、21、28 d的鸡爪苓菌丝体，用液氮研磨成粉末(3次)，加入1 ml Trizol，按照Trizol reagent说明书提取鸡爪苓菌丝体的总RNA，－80℃保存备用。

1.2.2 SMART法合成cDNA。加入总RNA、SMARTⅣ Oligonucleotide、CDS Ⅲ/3’PCR Primer，轻轻混匀后 72 ℃水浴 2 min，冰浴 2 min。再加入 5 × First-Strand Buffer、DTT、dNTP Mix、SMARTScribe MMLV RT，42 ℃水浴1 h，合成 First-Strand cDNA。取2 μl First-Strand cDNA至PCR管，加入去离子水、10 × Advantage 2 PCR buffer、50 × dNTP Mix、5'PCR Primer、CDSⅢ/3'PCR Primer和50×Advantage 2 Polymerase Mix。轻轻混匀后进行LD-PCR，反应条件:95℃ 1 min、95℃ 15 s、68℃ 6 min，22个循环，合成ds cDNA，4℃保存备用。

1.2.3 cDNA的纯化与酶切。将PCR产物用Proteinase K消化，酚仿抽提浓缩，用SfiⅠ酶切。采用CHROMA SPIN-400柱进行分级分离，收集单滴组分于16个离心管中，1%琼脂糖凝胶电泳检测分级分离结果，收集大于500 bp的基因片段组分，用醋酸钠、糖原和95%乙醇浓缩，溶解于7 μl去离子水中，－20℃保存备用。

1.2.4 λTripIEx2 载体的连接。分别取0.5、1.0 μl cDNA 与1 μl λTripIEx混合，加入T4连接酶，16℃过夜。混合2管连接产物，包装蛋白MaxPlaxTMLambda Packaging Extracts包装连接产物，加入600 μl噬菌体稀释缓冲液，25 μl氯仿，振荡混匀，去沉淀，即为原始文库。

1.2.5 原始文库的检测。将原始文库稀释10倍后，取1、10 μl与200 μl XL1-Blue的菌悬液混合，37 ℃孵育15 min，再加入IPTG和X-Gal各50 μl，移至3 ml顶层琼脂培养基，均匀倾倒于LB/MgSO4平板，37℃培养，检测噬菌斑蓝白斑数。

1.2.6 文库的扩增及检测。取10 μl原始文库与500 μl XL1-Blue的菌悬液混匀，37℃孵育15 min，移至3 ml顶层琼脂培养基，均匀倾倒于LB/MgSO4平板，37℃培养10 h，每个平板加10 ml噬菌体稀释缓冲液，4℃过夜，室温振荡1 h后收集缓冲液，分装至50 ml离心管，加入10 ml氯仿，7 000 r/min离心10 min，取上清，即为已扩增鸡爪苓菌丝体cDNA文库，保存备用。参照“1.2.5”滴定扩增的文库(不加IPTG和X-Gal)。随机选取23个噬菌斑，加入400 μl噬菌体稀释缓冲液，4℃过夜。取1 μl模板进行PCR鉴定。PCR反应条件:94 ℃ 2 min，94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，72 ℃ 10 min;30个循环。

1.2.7 EST分析。取5 μl鸡爪苓菌丝体全长cDNA文库，转入质粒pTriplEx2载体。随机选取20个单个菌落，采用菌落PCR检测转入成功率。根据PCR结果，选择6个片段较长的cDNA进行EST分析。

2 结果与分析

2.1 鸡爪苓菌丝体总RNA的提取 参照Trizol reagent试剂盒说明书，提取鸡爪苓菌丝体总RNA(图1)。结果显示，菌丝体培养时间不同，总RNA的产率不同。7、14 d鸡爪苓菌丝体总 RNA 的产量较高，分别为144.156、220.104 μg，28S与18S条带清晰，比例约为1.5∶1.0。鸡爪苓菌丝体培养21和28 d 产量较低，分别为71.638、3.580 μg，28S 与 18S 条带清晰，比例约为 1.5∶1.0。

2.2 鸡爪苓菌丝体的cDNA合成 用MMLV Reverse Transcriptase将鸡爪苓菌丝体总RNA反转录合成cDNA第一链，通过LD-PCR合成双链cDNA。电泳检测，cDNA弥散于500～2 500 bp(图2)，符合cDNA文库建库标准。

图1 Trizol法提取不同时间段鸡爪苓菌丝体总RNA

表1 不同时间段鸡爪苓菌丝体总RNA的提取

图2 LD-PCR合成产物双链cDNA

图3 鸡爪苓菌丝体cDNA的分级分离

2.3 cDNA片段的分级分离 鸡爪苓菌丝体cDNA经SfiI酶切后，用CHROMA SPIN-400柱进行分级分离，结果显示在第7管开始出现cDNA(图3)，收集第7～10个离心管内cDNA，纯化浓缩。

2.4 文库的滴度与插入片段的PCR检测 原始文库的滴度为1.66×106pfu/ml，蓝白斑筛选重组率为96.97%，扩增文库的滴度为3.88×109pfu/ml，达到文库构建标准。随机选取23个噬菌斑的PCR检测，PCR产物主要位于500～1 000 bp(图4)，符合EST测序的需要。

图4 cDNA文库插入片段的PCR产物

2.5 EST序列的分析 挑选5个单克隆，命名为cbsjzl1－5，(GenBank accession number:KM406240-KM406244)，进行测序。5个单克隆均含有ORF和UTR，其中4个ESTs存在高相似度的序列，并有相对应的蛋白质超家族，参与跨膜转运、信号转导、细胞的发育及分化等功能。

3 结论与讨论

cDNA文库是生物体某一时刻表达基因的集合，是获取新基因的重要手段，已广泛应用于不同生长阶段基因表达变化的研究、某特定发育期基因表达情况及获取组织特异性基因等方面［14－15］。影响cDNA文库质量的因素较多，mRNA的完整性、cDNA小片段及合适的载体都会对cDNA文库的代表性造成影响。该试验中，采取Trizol法可高效快速提取鸡爪苓菌丝体总RNA，降低mRNA的降解。通过CHROMA SPIN－400层析柱将cDNA分级分离，并选择合适的cDNA片段。选择λTripIEx作为载体，可提高某些低丰度基因的筛选率［16］。该试验成功构建了鸡爪苓菌丝体全长cDNA文库，可进行大规模的EST序列分析，为研究长白山区鸡爪苓的遗传特异性、探索鸡爪苓生长分化的分子机制提供理论基础。

［1］许广波，李艳茹，李太元，等.两个猪苓菌株生长速度及酯酶同工酶比较研究［J］.微生物学通报，2006，33(3):57 －59.

［2］许广波，李太元，李艳茹.药用真菌猪苓研究热点的进展［J］.延边大学农学学报，2012，34(3):262 －265.

［3］许广波，金敏，梁运江，等.长白山鸡爪苓子实体的组织分离培养及其酯酶同工酶分析［J］.延边大学农学学报，2013，35(4):284 －288.

［4］李艳茹，王健，于海茹，等.不同氮源对长白山鸡爪苓菌丝体生长及几种胞外酶活性的影响［J］.延边大学农学学报，2011，33(1):1 －5.

［5］XING X K，MA X T，HART M M，et al.Genetic Diversity and Evolution of Chinese Traditional Medicinal Fungus Polyporus umbellatus(Polyporales，Basidiomycota)［J］.PLOS ONE，2013，8(3):1 －10.

［6］戚淑威，赵琪，程远辉，等.猪苓的研究进展［J］.云南农业科技，2011(5):5－7.

［7］ZHOU W W，GUO S X.Studies on the chemical constituents of the Sclerotia of Polyporus umbellatus［J］.Acta Pharmaceutica Sinica，2007，42:249－253.

［8］SUN Y X，WANG S H，LI J B.Purification，structure and immunbiological activity of a new water－soluble polysaccharide from the mycelium of Polyporus albicans(Imaz.)Tenz［J］.Bioresource Technology，2008，99:900－904.

［9］WI YOUNG LEE，YOUNGKI PARK，JIN －KWON AHN.Cytotoxic activity of ergosta－4，6，8(14)，22－ tetraen－3－one from the Sclerotia of Polyporus umbellarus［J］.Bull Korean Chem Soc，2005，26:1464 －1466.

［10］刘开辉，邓百万，陈文强，等.比较DNA序列分析不同猪苓菌种的亲缘关系［J］.食用菌学报，2009，16(3):11 －13.

［11］宋超，郭顺星.药用真菌猪苓溶血素基因克隆和序列分析［J］.菌物学报，2013，32(4):690 －697.

［12］朱利军，长孙东亭，罗素兰.cDNA文库在药用海洋生物研究中的应用［J］.中国海洋杂志，2009，28(1):53 －58.

［13］晏惹君，黄兴奇，程在全.cDNA文库构建策略及其分析研究进展［J］.云南农业大学学报，2006，21(1):1 －6.

［14］PONGSOMBOON S，WONGPANYA R，TANG S，et al.Abundantly expressed transcripts in the lymphoid organ of the black tiger shrimp，Penaeus monodon，and their implication in immune function［J］.Fish Shellfish Immunol，2008，25:485 －493.

［15］叶波平，管悦，许媛媛，等.木榄幼苗叶片cDNA文库的构建及其表达序列标签分析［J］.热带亚热带植物学报，2010，18(2):140 －150.

［16］姚冬生，管敏，赵龙，等.产黄曲霉毒素解毒酶真菌(E－20)cDNA文库的构建［J］.广东药学院学报，2004，20(1):45 －48.