非线性化学指纹图谱技术在食醋鉴别中的应用研究

杨代明 方宣启

（湖南省食品质量监督检验研究院，湖南 长沙 410111）

食醋的质量因原料的种类、配比、酿造工艺等不同而异。酿造食醋是单独或混合使用各种含有淀粉、糖类、酒精的原料，经微生物发酵酿制而成的液体酸性调味液［1］，其色、香、味是由碳水化合物、蛋白质、脂肪及其它成分经曲霉菌、酵母菌和细菌发酵而生成的，组成极为复杂。以山西老陈醋为例，以高粱为主料，先加入多量酒曲，采用低温厌氧发酵产生酒精，再拌入谷糠、麸皮进行好氧发酵产生醋酸。将一半醋醅进行熏醅，另一半醋醅进行淋醋，以所得醋液再浸泡熏醅，淋得新醋。新醋再经夏日伏晒、冬季捞冰的长期陈酿和浓缩工序制成。内含多种有机酸（其中50%～60%醋酸及多种不挥发酸）、18种氨基酸、醇、酯、酚、醛、还原糖、多糖、黄酮、多酚等多种有机物及无机物（铁、钠、钙镁等）。配制食醋是以酿造食醋为主体即≥50%，与食用醋精、食品添加剂等混合物配制而成的调味食醋［2］。由于乙酸部分来源于酿造食醋，部分来源于冰乙酸，通过检测乙酸无法判断其来源的比例，采用化学分析及感官鉴定来判定食醋质量的优劣，并不能全面说明食醋的真正质量。

可见无论是生产原料、生产工艺，还是成品质量、滋味，酿造食醋和配制食醋都存在着比较大的区别。但酿造食醋和配制食醋的卫生标准基本一致，而液态发酵食醋和配制食醋的质量标准除总酸要求不一样外，均不要求不挥发酸，可溶性无盐固形物都要求大于0.5g/100mL，其他要求基本相同。由酒精为原料的液态发酵食醋及其配制醋只要求总酸，不要求可溶性固形物和不挥发酸。对以食用醋精配制的假配制食醋，其有机酸主要由90%～100%的醋酸组成，不挥发酸、氨基酸等物质很少或基本没有。这就使得酿造食醋和配制食醋及食用醋精勾兑的醋酸溶液（称之为化学食醋）可区分的界限不明显，难以从本质上鉴别酿造食醋和配制食醋，致使以“化学食醋”充当配制食醋或酿造食醋、以配制食醋充当酿造食醋的现象相当严重，由于鉴别真伪的标准缺失，无法进行规范。

色谱指纹图谱［3－5］是国际公认的中药及天然药物的真伪鉴别和质量控制的最有效的手段。非线性化学指纹图谱技术的原料与色谱指纹图谱技术是截然相反的，能参与振荡反应的所有物质整体表现在E—t曲线上是否振荡、振荡时间、振荡周期、振荡周期数及振荡峰谷连线、振荡峰连线的曲线形状中，已经成功应用于中药鉴别［6－9］。前期笔者已经对非线性化学指纹图谱技术在食醋鉴别中的原理进行了研究［10］。本研究拟采用非线性化学指纹图谱技术对酿造食醋和配制食醋进行鉴别，旨在研究出能整体表征酿造食醋含量的新方法。

1 材料与方法

1.1 仪器

非线性化学指纹图谱测定仪：MZ-1A型，配217型复合甘汞电极，中南大学与湖南尚泰测控科技有限公司联合研制；

金属铂电极：213型，上海精密科学仪器有限公司；

自动电位滴定仪：ZDJ-400D型，北京先驱威锋技术开发公司。

1.2 材料与试剂

硫酸、丙酮、硝酸银：分析纯，国药集团化学试剂有限公司；

溴酸钠：分析纯，天津市科密欧化学试剂有限公司；

硫酸锰：分析纯，台山市粤侨试剂塑料有限公司；

食用醋精：濮阳市天口实业有限公司；

食醋样本（见表1）：加加集团（长沙）有限公司。

表1 食醋样本编号、名称及来源Table 1 Numbers，names and source of vinegar samples

1.3 试验方法

1.3.1 样品供试液的制备 取2.0mL食醋样品于烧杯中，用自动电位滴定法测出食醋中NaCl的含量。准确量取1 00mL食醋样本，加入适量硝酸银，并充分搅拌至恰好完全沉淀溶液中氯离子，离心，取上清液备用。

1.3.2 非线性化学指纹图谱的分析方法 准确加入适量的去盐后的食醋样品、25mL H2SO4溶液、8mL丙酮溶液和15mL硫酸锰溶液于反应器中，盖好带温度计、注射孔和电极的反应器盖。开启超级恒温仪调节反应器内温度为37.0℃，恒温、恒速搅拌10.0min时，通过注射器迅速加入5.0mL溴酸钠溶液，即刻点击菜单采集数据，记录非线性化学指纹图谱至电位振荡消失并出现电位平衡曲线为止。

1.3.3 不同酿造食醋含量的配制食醋非线性化学指纹图谱试验 以编号BY-1的加加陈醋为母液，配制含加加陈醋12.5%，25.0%，37.5%，50.0%，62.5%，75.0%，8 7.5%，100.0%的食醋样品，添加适量食用醋精、苯甲酸、炒米色等使总酸及外观与母液一致。分别取8mL上述样品溶液按1.3.2分析。

2 结果与讨论

2.1 食用醋精及不同酿造食醋含量样品的非线性化学指纹图谱分析

B－Z体系，是指由溴酸盐、有机物在酸性介质中，在有（或无）金属离子催化剂下构成的体系。经典B－Z振荡反应认为，有机底物和催化剂是关键。凡 Mn＋1＋e→Mn＋电极电位在1.51～1.00V的金属离子均可作为溴酸盐体系的催化剂，如Ce3＋/Ce4＋（1.44eV），Mn2＋/Mn3＋（1.94eV），即使某些金属离子不能达到此条件，但其络合物的电极电位却可满足 要 求，Ru （bpy）23＋/Ru （bpy）33＋（约 1.3eV），Fe（C12H8N2）23＋/Fe（C12H8N2）33＋（1.06eV）。对 于 有 机 底物，要求其电极电位在1.0V以下，一些具有活泼亚甲基的含氧有机化合物恰好符合此条件，如丙二酸、溴化丙二酸、马来酸、苹果酸、酒石酸、柠檬酸、乙酰丙酮、乙酰乙酯等，脂肪族多元羧酸和多元酮及酯都可以作为B－Z反应的有机底物，苯酚、苯胺及其衍生物无需催化剂就可以产生振荡反应，草酸、酒石酸、糖类、氨基酸等难以发生溴代反应的有机物，可通过加入溴代剂（如丙酮）构成复合底物产生振荡反应。酿造食醋的主要成分是醋酸，还含有丰富的钙、氨基酸、琥珀酸、葡萄酸、苹果酸、乳酸、B族维生素及盐类等对身体有益的营养成分。氨基酸、琥珀酸、苹果酸、乳酸等能作为振荡有机底物促使化学振荡的产生及维持。在“H＋＋Mn2＋＋BrO－3＋丙酮”中加入一定体积的食醋样本，有机底物达到一定临界浓度时可诱发振荡反应，出现振荡现象。

本试验取8mL用食用醋精、BY-1、BY-3及按1.3.3制成的配制食醋样品按1.3.2试验方法加入到“H＋＋Mn2＋＋BrO－3＋丙酮”中，获得的非线性化学指纹图谱E—t曲线（见图1（为BY-1样品的））。食用醋精因不含有机酸、酯、糖等能作为振荡体系耗散物的物质而不发生振荡反应（见图1（l）），而酿造食醋含量≥37.5%的配制食醋方能发生振荡反应（见图1（c）～（h））。因为酿造食醋（以酒精为原料的发酵食醋除外）和以酿造食醋为主体的配制食醋，均含有有机酸、醇、酯、酚、醛、糖等多种有机物，有些还含有川芎素、黄酮、多酚功能性成分。当BY-1样品的酿造食醋含量低于37.5%（但BY-3样品则为30%）时，体系中因耗散物的浓度不足，不能达到振荡反应条件而不发生化学振荡，其E—t曲线为一条平直的直线。这表明，若加入食醋样品20min内不发生化学振荡反应，表明其酿造食醋的含量低于37.5%或30%。随着BY-1或BY-3样品的酿造食醋浓度的增大，其非线性化学指纹图谱出现规律性的变化，振荡寿命越来越长，振荡周期数越来越多（见表2）。

由图1（c）～（h）可知，在一定浓度范围内，增加相同量的振荡底物，振荡周期数增加越多，振荡周期数（y）与酿造食醋含量（x）呈二次函数关系：对于BY-1样品而言：y＝0.007 7x2－0.592 9x＋12.823（37.5≤x≤100）；对于BY-2样品而言：y＝0.008 8x2－0.667 4x＋14.052（30≤x≤100），y值取小数点后一位，相关系数r分别达到0.996和0.997。其中，BY-1样品的酿造食醋含量达到37.5%时，体系发生振荡反应，出现第1个周期性振荡；BY-3样品的酿造食醋含量在30%时产生首次振荡现象。这表明含30%BY－3（为香醋）的样品比含37.5%BY-1（为陈醋）的样品中有机振荡底物的含量略高些，实际上BY-3样品及BY-1样品的可溶性无盐固形物含量分别为7.1%和7.5%，表明发生振荡反应所需最低底物浓度（阀值）是一致的。低于50%BY－1含量的配制食醋振荡周期数小于3个振荡周期，或振荡寿命小于7.5min时，可以判断该产品为BY-1酿造食醋含量不合格的勾兑食醋。BY-1酿造食醋含量高于50%，不到100%的配制食醋，其振荡周期数或振荡寿命明显少于100%的酿造食醋。

因此，非线性化学指纹图谱较易判断食醋样品是否为配制食醋或酿造食醋，食醋振荡周期数与酿造食醋含量的关系至少可以作为企业对自身产品进行在线质量控制的有效检验方法，或可以作为企业识别市场上假冒伪劣自身产品的有效检验方法。

图1 食用醋精及不同酿造食醋含量的样品的非线性化学指纹图谱E—t曲线Figure 1 Nonlinear chemical fingerprint E—t curve of samples of different amount of fermented vinegar and edible vinegar

表2 样品中BY-1酿造食醋含量与振荡寿命、振荡周期数的关系Table 2 The relationship of BY-1fermented vinegar amount of sample and oscillation life，oscillation periodic number

2.2 食醋的可溶性无盐固形物与非线性化学指纹图谱振荡周期的关系

以BY-2、BY-3为母液，配制不同含量可溶性无盐固形物的食醋溶液，并于丙酮体系中试验，获得的非线性化学指纹图谱振荡周期对可溶性无盐固形物作图，见图2。由图2可知，随着可溶性无盐固形物含量的增大，非线性化学指纹图谱的振荡周期减小，可溶性无盐固形物含量（y）与振荡周期（x）的关系为：对 BY-2的酿造食醋而言，y＝0.109 5x2－1.915 4x＋17.255；对BY-3的酿造食醋而言，y＝0.228 5x2－3.047 9x＋19.014 4，可见，至少对同一个企业生产的酿造食醋产品而言，其变化趋势是一致的。可溶性无盐固形物是食醋内容物含量指标，其含量的高低，直接反映酿造食醋的品质好坏。因此，振荡周期也可用于表征食醋的质量。振荡周期越小，则食醋质量越好。

图2 食醋振荡周期与可溶性无盐固形物的关系Figure 2 The relationship of vinegar oscillation period and soluble saltless solid

3 结论

勾兑食醋因不含振荡底物，不发生化学振荡，而酿造食醋与配制食醋均能发生非线性化学振荡反应，且配制食醋的振荡寿命、振荡周期数明显小于酿造食醋。利用非线性化学指纹图谱技术能很好地将勾兑食醋、配制食醋和酿造食醋鉴别开来，振荡周期与可溶性无盐固形物的含量呈规律性的变化，振荡周期数也随着酿造食醋含量增加而愈发明显地增多。用非线性化学指纹图谱技术鉴别和评价食醋，为酿造食醋、配制食醋的鉴别和质量评价提供了一种经济、易行、简便和有效的方法。

1 国家国内贸易局.GB 18187—2000 酿造食醋［S］.北京：国家质量技术监督局，2000.

2 由全国调味品标准化技术委员会.SB 10337—2000 配制食醋［S］.北京：中华人民共和国商务部，2000.

3 王夏炎.现代分析技术在中药指纹图谱研究中的应用［J］.中草药，2004，35（7）：6～9.

4 Jin Y，Liang T，Fu Q，et al.Fingerprint analysis of Ligusticum chuanxiong using hydrophilic interaction chromatography and reversed-phase liquid chromatography［J］.J.Chromatogr A，2009，1 216（11）：2 136～2 141.

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6 Zhang T M，Liang Y Z，Yuan B，et al.Principle，traits and functions of electrochemical fingerprint for distinguishing and evaluating Chinese traditional medicine［J］.Chin Sci.Bull，2007，52（20）：2 753～2 765.

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8 张泰铭，梁逸曾，袁斌，等.中药电化学指纹图谱的原理、特点和用途［J］.科学通报，2007，52（13）：1 513～1 522.

9 张泰铭，梁逸曾，袁斌，等.中药电化学指纹图谱的检测方法和条件因素［J］.科学通报，2007，52（9）：1 012～1 120.

10 杨代明，方宣启，冯敏，等.食醋非线性化学指纹图谱掺伪鉴别原理的研究［J］.食品与机械，2012，28（1）：86～92.