益肠平对溃疡性结肠炎小鼠结肠通透性的预防作用

黄循铷，王瑞幸，王承党

2.福建医科大学 生理学与病理生理学系，福州 350004

溃疡性结肠炎（ulcerative colitis，UC）是一种病因不明的终身性疾病，主要表现为非特异性结、直肠炎症。目前UC主要治疗药物有氨基水杨酸、糖皮质激素、免疫抑制剂、生物制剂及中药[1]，益肠平是民间治疗UC有效的中药复方。本文采用2.5%葡聚糖硫酸钠（dextran sulfate sodium，DSS）定量灌胃诱导小鼠UC，并通过测定结肠损伤大体评分（macroscopic assessment of colonic damage，MACN）、结肠通透性、丙二醛（malondialdehyde，MDA）、结肠组织超氧化歧化酶（superoxide dismutase，SOD）及诱导型一氧化氮合酶（inducible nitric oxide synthase，iNOS），评价益肠平对UC小鼠结肠通透性的预防作用，并初步了解其作用机制。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 动物 清洁级雄性ICR小鼠120只，8～10周龄，体质量（27±2）g[福建医科大学实验动物中心，许可证号SCXK（闽）2009－0002]。

1.1.2 试剂及仪器 益肠平（由连翘、蚤休及泡山甲等12种中药组成）生药浓度1.235g／mL，由福建医科大学药学系提供；DSS（批号：4455H，美国ICN公司）；伊文思兰（批号：104K3717，美国Sigma公司）；iNOS一抗（批号：9242P503B，美国 Labvision公司）；二步法抗兔免疫组织化学检测试剂盒（批号：GK400305，广州基因有限公司）；柳氮磺吡啶（Sulfasalazine suppositories，SASP，批号20090523，上海三维制药有限公司）；SOD（批号20090413）、MDA（批号20090421）试剂盒（南京建成生物工程研究所）。正置显微镜（BX50F型，日本Olympus optical有限公司）；超声波细胞粉碎仪（GE50型，美国Thomas scientific公司）。

1.2 方法

1.2.1 分组 小鼠随机分为6组，每组20只：（1）正常 对照组；（2）模型对照组；（3）SASP 组；（4）益肠平高剂量组（YCP1）；（5）益肠平中剂量组（YCP2）；（6）益肠平低剂量组（YCP3）。

1.2.2 UC模型制作 模型对照组、SASP组及YCP1、YCP2及 YCP3组每天分别于10：00、14：00和18：00给予2.5%DSS溶液定量灌胃，每次30mL／kg，每天末次灌胃后给予足量混合配方颗粒饲料，次日08：00取走饲料，连续9d；正常对照组以蒸馏水代替2.5%DSS[2]。

1.2.3 治疗 造模开始同时给药：YCP1、YCP2及YCP3组分别给予相同容积（0.125mL／10g体质量）、不同生药浓度（0.617、0.308、0.154g／mL）的益肠平溶液，每日2次，即每只小鼠用药量分别为30.8、15.4、7.7g·kg－1·d－1。SASP组给予相同容积（0.125mL／10g体质量）的0.8%SASP悬液，每日2次。以上药液均为灌胃，给药时间距DSS给药时间2h，连续9d。正常对照组及模型对照组以蒸馏水代药[2]。

1.3 观测指标

1.3.1 MACN评分 各组随机取10只小鼠脱颈椎处死，取全结肠，漂洗后于解剖显微镜下观察及评分。MACN＝溃疡评分＋粘连评分＋粪便评分。溃疡评分：0分：正常；1分：局部水肿、无溃疡；2分：一个溃疡，无增厚、水肿；3分：一个溃疡伴增厚、水肿；4分：最明显的溃疡沿肠壁纵轴的长度＞1cm；5～10分：溃疡长度沿结肠纵轴＞2cm（每一溃疡增加1cm增加1分）。粘连评分：0分：无；1分：较少；2分：较多，不易分离。稀便：0分：无；1分：有[3]。

1.3.2 结肠通透性测定 取余下10只小鼠禁食不禁水24h，经肛门插入直径为1mm硅胶管，注入0.5%肥皂水洗肠，15min后用清水冲洗2次。洗肠后30min，氯胺酮麻醉下自小鼠结肠给予1.5%伊文思兰0.2mL，立即缝合肛门。15min后处死小鼠，取全结肠，剪开肠腔，用6mmol／L N－乙酰半胱氨酸漂洗。将肠段置于恒温箱37℃12h烘干，称重后放入1mL甲酰胺55℃孵育24h，取100μL孵育液于酶标仪上测定620nm波长处的吸光度，计算伊文思蓝量。以进入肠壁内伊文思兰的量（μg／mg肠段质量）反映结肠通透性[4]。

1.3.3 结肠组织MDA及SOD测定 取病变最明显处0.5cm结肠组织，制备10%组织匀浆，经3次冻融后离心取上清液提纯。结肠黏膜MDA及SOD的测定按试剂盒说明进行[4]。

1.3.4 结肠组织iNOS测定 取病变较明显的部位0.5cm，常规固定、包埋、切片，采用免疫组织化学Envison TM二步法测定。结肠iNOS表达以细胞浆染为棕色或浅棕色为阳性，采用Image Pro－Plus 5.1图像分析软件进行定量分析。比较各组小鼠结肠组织单位面积阳性细胞数。

2 结 果

2.1 MACN评分 造模后3d模型小鼠均逐渐出现腹泻、血便、消瘦等类似人类UC的表现。造模后9d正常对照组小鼠结肠黏膜光整，模型对照组结肠短缩，黏膜充血水肿明显，见浅表溃疡形成，部分见息肉样隆起，其余各组结肠黏膜充血水肿较模型对照组减轻。模型对照组MACN评分较正常对照组显著增高，SASP组、YCP1、YCP2、YCP3组较模型对照组显著降低，差别有统计学意义（P＜0.05）。YCP1、YCP2、YCP3组与SASP组比较，差别无统计学意义（P＞0.05）（表1）。

2.2 结肠通透性 正常对照组结肠粘膜光整，少许呈淡蓝色；模型对照组结肠粘膜充血水肿，病变处呈深蓝色。模型对照组结肠通透性较正常对照组显著增高，差别有统计学意义（P＜0.05）；SASP组及YCP1、YCP2、YCP3组较模型对照组显著降低，差别有统计学意义（P＜0.05）；SASP组较 YCP1、YCP2、YCP3组差别无统计学意义（P＞0.05）（表1）。

2.3 结肠组织MDA、SOD水平 模型对照组较正常对照组小鼠结肠MDA水平显著增高、SOD水平显著降低，差别有统计学意义（P＜0.05）；SASP组、YCP1、YCP2、YCP3组与模型对照组比较，差别有统计学意义（P＜0.05）；SASP组与 YCP1、YCP2、YCP3组比较，差别无统计学意义（P＞0.05）（表1）。

2.4 结肠组织iNOS表达 正常对照组iNOS无表达或仅少量表达于结肠黏膜上皮细胞的胞浆。模型对照组较正常对照组表达明显增多，阳性区域位于结肠黏膜上皮细胞，肠腺上皮细胞，炎症细胞及血管内皮细胞的胞浆。模型对照组iNOS阳性单位数值较正常对照组显著增高，差别有统计学意义（P＜0.05）；SASP组、YCP1、YCP2、YCP3组较模型对照组显著降低，差别有统计学意义；SASP组较YCP2、YCP3组表达较低，差别有统计学意义（P＜0.05）（图1，表1）。

表1 各组小鼠MACN评分、结肠通透性（EB／肠质量）、结肠MDA、SOD及iNOS的表达情况Tab 1 MACN，colonic permeability，MDA，SOD and iNOS expression level in different groups mouse

2.5 结肠通透性、MACN 评分、MDA、SOD 及iNOS的相关性分析 Pearson相关分析提示，小鼠结肠通透性与 MACN评分（r＝0.511，P＝0.009）、MDA（r＝0.470，P＝0.011）、iNOS（r＝0.542，P＝0.006）均有显著正相关；与SOD（r＝－0.520，P＝0.007）呈显著负相关。

3 讨 论

UC以腹痛、腹泻及黏液血便为主要症状，其发病机制未明。近年来，结肠屏障受损、结肠通透性增高逐渐成为UC发病机制研究的热点。结肠屏障由机械屏障、免疫屏障、化学屏障和生物屏障组成。当结肠屏障受损后，结肠通透性增高，肠腔内的细菌或食物等抗原进入肠壁，启动肠道粘膜免疫反应进而导致肠道免疫及炎症反应。通过人类炎性肠病患者及一些动物模型的研究已经发现，肠道通透性的改变在疾病发病数月之前就已出现，它可能是UC起病及反复发作的一个重要环节[5]。本研究采用2.5%DSS定量灌胃成功诱发小鼠UC，造模小鼠出现明显的腹泻、粘液血便，类似人类UC。UC小鼠结肠通透性与MACN明显增高并呈密切正相关。与模型组比较，益肠平治疗组MACN及结肠通透性明显降低，差别有统计学意义，提示益肠平对UC小鼠结肠大体病理表现及降低结肠通透性均有显著的改善作用。

肠道通透性受TNF－α等多种前炎症因子网络调节，并与肠黏膜的氧化应激状况有关[4]。液体及溶质主要通过经细胞转运途径和细胞旁路途径两种方式进入结肠黏膜，后者主要是通过黏膜上皮细胞间的紧密连接来实现，是中、大分子通过肠道屏障的重要途径。已有研究表明，结肠自由基产生增加，可导致结肠屏障受损，结肠通透性增高[4]。自由基包括氧自由基和NO自由基，SOD反映了组织清除氧自由基的能力，而MDA则是脂质代谢产物，它们反映了细胞受氧自由基攻击的严重程度。而测定结肠组织iNOS，可以反映结肠NO自由基损伤程度。

益肠平由银花、连翘、蒲公英、蚤休、茵陈以及赤芍等12种中药组成。体内、外实验研究已经表明，本方所含的银花、连翘、蒲公英、蚤休对结肠杆菌、痢疾杆菌等肠道细菌有较强的抗菌作用；连翘有降低血管内皮渗透性的作用；茵陈有清热抑菌，抑制肠管过度蠕动的作用。本配方是在用于临床治疗泄泻的经验方取得较好疗效的基础上，结合本病以免疫异常及感染为主要因素的发病机制，以健脾渗湿、去腐排脓、生肌敛疮为治则配方而成，旨在消除溃疡、调节免疫、促进炎症吸收的作用。本研究结果提示，UC小鼠结肠SOD水平明显降低，MDA及iNOS水平明显增高，显示UC小鼠结肠受自由基损伤明显，益肠平治疗后上述指标明显改善，并呈剂量依赖性。各组小鼠自由基水平与结肠通透性密切相关，提示益肠平可能通过降低结肠黏膜自由基水平而降低结肠通透性。

综上所述，益肠平能有效改善UC小鼠结肠通透性，这可能基于其可有效降低UC小鼠结肠自由基损伤、保护结肠屏障，但其进一步的分子机制尚需今后进一步研究。

[1]王瑞幸，黄循铷，方秋娟，等.补黄丹对小鼠免疫性溃疡性结肠炎的治疗作用[J].福建医科大学学报，2006，40（1）：37－39.

[2]黄循铷，王承党，王瑞幸.葡聚糖硫酸钠自由饮用与定量灌胃诱导急性结肠炎模型的对比研究[J].胃肠病学，2009，14（1）：27－30.

[3]Fitzpatrick L R，Small J S，Doblhofer R，etal.Vidofludimus inhibits colonic interleukin－17and improves hapten－induced co－litis in rats by a unique dual mode of action[J].Pharmacol ExpTher，2012，342（3）：850－860.

[4]黄循铷，王瑞幸，王承党.小鼠溃疡性结肠炎结肠通透性改变及其与自由基的关系[J].中华消化杂志，2010，3（1）：557－559.

[5]Yan Y，Laroui H，Ingersoll A，etal.Overexperssion of Ste20－related proline／alanine－rich kinase exacerbates experimental colitis in mice[J].JImmunol，2011，187（3）：1496－1505.