血栓心脉宁对大鼠脑缺血再灌注损伤后血管内皮生长因子表达的影响

杨小霞，李国前，陈春雷，王杰华，潘 莹

2.南安市第二医院 神经内科，南安 362300

急性缺血性脑血管病是由于脑血流突然中断而导致脑组织缺血、坏死的一种严重危害人类健康的疾病。预防和治疗缺血性脑血管病已成为当前神经病学研究的一个重要课题。血栓心脉宁是治疗脑缺血性疾病的中成药，能降低血黏度、改善血小板聚集率、升高血流量[1]。本研究在建立大鼠脑缺血再灌注损伤模型，从促血管生长因子表达的角度探讨血栓心脉宁的脑保护作用机制。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 动物 健康雄性SD大鼠24只，体质量250～300g（福建医科大学实验动物中心，动物合格证号：SCXK2012－0001）。随机分为3组：假手术组、模型组和实验组，每组8只。

1.1.2 试剂 血栓心脉宁片（吉林华康药业股份有限公司），实验时以无菌生理盐水配制成所需浓度；兔抗大鼠血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）抗体（美国 Santa Cruz公司）；即用型免疫组织化学试剂盒（鼠／兔）（福州迈新生物技术开发有限公司）；Trizol试剂（美国Invitrogen公司）；PCR试剂盒及逆转录试剂盒（美国MBI Fermentas公司），引物由上海生工生物工程有限公司合成。

1.2 方法

1.2.1 模型制作和给药方法 实验组于造模前每日灌胃给药1次（800mg／kg）[2]，连续6d；假手术组和模型组予相同体积的无菌生理盐水。模型组和实验组参考改良Zea－Longa线栓法制备大鼠大脑中动脉栓塞模型[3]。血流阻断1h后拔出线栓，形成再灌注。假手术组大鼠接受相似手术处理，但是不插入线栓。再灌注24h后处死动物断头取脑，取右侧大脑半球视交叉后6～11mm的脑组织备用。

1.2.2 H－E染色 大鼠脑组织制作5μm厚的石蜡切片，经脱腊至水，先后加入苏木素、伊红溶液进行染色，经脱水透明，中性树胶封片，在200倍光学显微镜下观察脑组织。

1.2.3 免疫组织化学法检测VEGF蛋白的表达大鼠脑组织切片经脱腊至水，按照试剂盒说明书操作，兔抗大鼠VEGF一抗浓度1∶200，AEC室温显色，自来水冲洗，苏木素复染，水性封片剂封片。阴性对照用PBS代替一抗。阳性细胞计数：每只大鼠脑组织取5张切片，每张切片在400倍光学显微镜下随机选取5个视野，分别计数免疫反应阳性细胞数，取平均值。

1.2.4 半定量PCR法检测VEGF mRNA的表达

取大鼠脑组织按Trizol法提取总RNA并进行逆转录反应。PCR扩增反应条件为：变性94℃30s→退火64℃30s→延伸72℃30s，反应循环数为34。反应完毕后扩增产物进行电泳，凝胶成像分析仪拍照记录。用Quantity One图像分析软件测定各条带灰度，以目的基因灰度值与β－actin灰度值的比值作为特异性扩增目的基因的半定量检测值。

2 结 果

2.1 H－E染色结果 造模成功后，模型组和实验组缺血区脑组织结构稀疏，神经细胞变形，核固缩，核碎裂，核溶解，并失去完整的结构（图1）。

2.2 VEGF蛋白 VEGF免疫阳性细胞的胞质和／或胞核呈红色。假手术组仅见少量VEGF阳性细胞表达；模型组VEGF阳性细胞表达较假手术组显著增多，2组差别有统计学意义（P＜0.05）；实验组VEGF阳性细胞表达较模型组显著增多，2组差别有统计学意义（P＜0.05）（表1，图2）。

2.3 VEGF mRNA VEGF mRNA在假手术组有微弱表达，在模型组表达较假手术组显著增高，2组差别有统计学意义（P＜0.05），实验组表达含量较模型组显著增高，2组差别有统计学意义（P＜0.05）（表1，图3）。

表1 各组大鼠VEGF表达的比较Tab 1 Comparison of the VEGF expression in different groups

图1 各组大鼠脑组织H－E染色（ ×200）Fig 1 H－E staining of rats brain tissue（ ×200）

图2 免疫组织化学法检测大鼠VEGF蛋白表达（ ×400）Fig 2 VEGF protein expression detected by immunohistochemistry（ ×400）

图3 PCR法检测大鼠VEGF mRNA表达Fig 3 VEGF mRNA expression detected by PCR

3 讨 论

缺血性脑损伤后，缺血半暗带区的神经细胞如能及时恢复血流灌注，可使其神经功能恢复。VEGF为对血管内皮细胞最具特异性的有丝分裂原，能促进缺血局部血管再生，这对于改善缺血半暗带血液供应，挽救濒死的神经细胞意义重大[4]。同时有研究发现，VEGF能刺激轴突生长和改善神经细胞的存活，在病理状态下对中枢神经系统有保护作用，局部应用 VEGF可有效减少梗死面积[5－6]。本研究结果发现，脑缺血再灌注损伤后，模型组VEGF的表达明显高于假手术组，说明VEGF在缺血性脑损伤后水平是升高的。

血栓心脉宁系由川芎、丹参、水蛭、毛冬青、牛黄、麝香、槐米、人参茎叶皂苷、冰片和蟾蜍等中药组成的复方制剂，具有芳香开窍、活血散瘀功能，主治脑血栓、冠心病、心绞痛等气滞血瘀证者[7]。有研究表明，血栓心脉宁能明显减轻脑缺血损伤后脑水肿，提高全脑缺血小鼠的耐缺氧能力，增加正常大鼠脑膜血流量[8]。本研究结果发现，脑缺血再灌注损伤后予血栓心脉宁进行治疗，VEGF的表达明显高于模型组，说明血栓心脉宁能促进脑缺血区促血管生成因子的表达，从而发挥脑保护作用。

[1]侯电波，于华明，薛彦君.血栓心脉宁胶囊治疗急性脑梗塞的疗效观察[J].辽宁中医杂志，1998，25（5）：207.

[2]赵星宇，睢大员，于晓风，等.血栓心脉宁片对大鼠急性心肌梗死的保护作用及其机制[J].中西医结合心脑血管病杂志，2008，6（2）：177－179.

[3]Longa E Z，Weinstein P R，Carlson S，etal.Reversible middle cerebral artery occlusion without craniectomy in rats[J].Stroke，1989，20（1）：84－91.

[4]韩 巨，孙 燕，张 涛，等.缺血耐受大鼠局灶性脑梗死后血管再生的实验研究[J].山东大学学报：医学版，2011，49（3）：8－12.

[5]Sondell M，Lundborg G，Kanje M.Vascular endothelial growth factor has neurotrophic activity and stimulates axonal outgrowth，enhancing cell survial and schwann cell proliferation in the peripheral nervous system[J].Neurosci，1999，19（4）：5731－5740.

[6]Sondell M，Kanje M.Postnatal expression of VEGF and its receptor Flk－1in peripheral ganglia[J].Neuroreport，2001，12（1）：105－108.

[7]杨春梅，刘 兵，睢大员，等.血栓心脉宁胶囊对大鼠实验性心肌梗死的保护作用[J].武警医学，2005，16（5）：352－354.

[8]杨小霞，李国前，王杰华，等.血栓心脉宁片对大鼠脑缺血再灌注肿瘤坏死因子－ɑ的影响[J].中西医结合心脑血管病杂志，2011，9（11）：1363－1364.