半枝莲多糖对肝癌小鼠差异表达蛋白质影响的实验研究

于水澜，于英君，许晓义，关利新，刘佳维，朱雁飞，宋高臣

(1．黑龙江中医药大学，黑龙江 哈尔滨 150040;2．牡丹江医学院，黑龙江 牡丹江 157011)

半枝莲(Scutellaria barbata D．Don)为唇形科黄芩属植物，味辛、微苦，性寒，归肺、肝、肾经，具有清热解毒，散癖止血，利尿消肿、抗癌等功效［1］，是中医处方和成药中的常用中药。近代药理学研究表明，半枝莲具有抗肿瘤［2－4］、抗氧化［5］、抗病毒［6］、抑菌［7］、解热［8］、保肝［9］等活性。半枝莲作为一种常用的抗肿瘤中药，现代在临床上应用于治疗肝癌、胃癌、肺癌、直肠癌、鼻咽癌等且疗效确切［10］。其中半枝莲多糖(SB-PS)是从半枝莲中分离的主要功能性成分之一。

本实验运用蛋白质组学技术中的2－DE与图像分析技术，将SBPS作用H22肝癌小鼠后的血清与肿瘤组血清分别进行分离和比较分析，通过比对分析找出差异表达的蛋白，为进一步筛选出SBPS抑制肿瘤活性的靶位蛋白奠定基础。

1 实验材料

1．1 动物与廇株

昆明种小鼠20只，体质量(20±2．0)g，雌雄各半，由黑龙江中医药大学实验动物中心提供;小鼠转移性腹水型肝癌细胞株(H22)，由中国医学科学院肿瘤研究所引进。

1．2 主要试剂

半枝莲多糖(宁波德康生物制品有限公司);固相pH梯度干胶条(7cm，pH值3～10);固相pH梯度干胶条(18cm，pH 值4～7);IPG Buffer、覆盖液、等电点标准、甘油(Glycerol);2D Qunat Kit蛋白定量试剂盒、溴酚蓝(Bromophenol blue)均由 GE Amersham Biosiences公司提供;ProteoExtractTMAlbumin/IgG Removal Kit(Calbiochem 公司);DTT、IAM、TEMED、CHAPS、β－巯基乙醇等(Sigma公司);其他试剂均为标准实验试剂。

1．3 主要仪器

680 分光光度计(Bio－Rad公司);3K15高速离心机(Sigma公司);纯水装置(Millpore公司);Ettan DALT twelve system电泳仪、Ettan IPGphor3等点聚焦仪、ImageMaster 5．0 分析软件(GE Amersham Biosiences公司);PowerLook 2100XL扫描仪(UMAX Powerlook公司)。

2 实验方法

2．1 H22肝癌小鼠实验模型建立与分组

无菌条件下抽取接种第6～7天的生长良好的H22肝癌小鼠的腹水(活癌细胞数＞97%)，生理盐水1:3稀释，0．2%台盼蓝染色，计活细胞数大于95%，无菌操作小鼠右前肢腋部皮下接种0．2mL/只制备实体瘤模型。将接种H22细胞的实体瘤小鼠随机分为两组，每组10只，分别为肿瘤组和SBPS组。于接种6h后开始腹腔注射给药，SBPS组100mg/(kg·d)，肿瘤组小鼠给予同体积的生理盐水。每日1次，直到肿瘤组肿瘤达到lg以上。

2．2 血清样品制备

小鼠摘眼球取血，取完血后4℃静置30min，然后以3000g离心20～30min，取上清，同组血清样品混合后，分别将两组血清分装置于－80℃冰箱保存。利用ProteoPrep Blue Albumin and IgG Depletion Kit对血浆样品进行去除白蛋白和免疫球蛋白(实验步骤按照操作说明书)。用2－D Quant Kit进行蛋白浓度测定(实验步骤按照操作说明书)，得上清液为蛋白样本。

2．3 双向凝胶电泳

双向凝胶电泳(2－DE)操作步骤按应其使用说明进行;取两组小鼠血清(SBPS组和肿瘤组)蛋白样品，进行第一向固相pH梯度等电聚焦，平衡胶条，再进行第二向SDS－PAGE电泳，重复两次。

2．4 图像扫描及分析

双向电泳凝胶采用UMAX公司的PowerLook 2100XL扫描仪进行扫描，运用GE Amersham公司的ImageMaster 5．0软件对凝胶数据进行分析。

2．5 统计学处理

实验数据的统计分析采用SPSS 13．0软件，组间蛋白的差异点采用卡方检验，组间蛋白点匹配率的比较采用T－test检验。

3 结果

3．1 血清2－DE的重复性

在相同条件下，分别对肿瘤组和SBPS组血清进行两次2－DE图谱的重复性匹配分析，肿瘤组和SBPS组两块胶图斑点的匹配率分别为99.85%和99.81%，此实验可获得重复性较好的血清2－DE图谱。

3．2 肿瘤组和SBPS组血清的2－DE图谱

肿瘤组和SBPS组血清的2－DE图谱(见图1)总蛋白质点分别为(335±3)、(252±7)个。应用 ImageMaster 5．0软件分别对两组2－DE图谱进行匹配分析后，肿瘤组与SBPS组间蛋白表达差异3倍以上的点共有18个(见图2)，其中在SBPS组中6个蛋白点表达上调，1个蛋白点表达下调，1个蛋白点在SBPS组特异表达，10个蛋白点在SBPS组表达缺失，如表1～2所示。

表1 肿瘤组与SBPS组表达量相差3倍以上的蛋白质点

图1 肿瘤组(左)和SBPS组(右)蛋白表达图谱

图2 肿瘤组与SBPS组2－DE凝胶图谱中的差异蛋白点

表2 肿瘤组与SBPS组特有的蛋白质点

4 讨论

多糖作为一种重要的天然大分子物质，其抗肿瘤药理作用已经得到肯定［11－12］。半枝莲多糖(Scutellaria barbata Polysaccharides，SBPS)是从半枝莲中分离的主要有效成分之一。张秀娟等［13］研究表明，半枝莲多糖在体内对S180肉瘤的生长有一定的抑制作用，宋高臣等［14］研究发现，半枝莲多糖能够抑制小鼠HepA肿瘤生长，增加免疫器官重量。但半枝莲多糖对肝癌的抑制作用机制鲜见报道，还有待进一步研究。

双向凝胶电泳技术作为蛋白质组学研究的核心技术之一，广泛应用于寻找肿瘤发生发展相关蛋白的研究中。实验对比分析两组血清蛋白的2－DE图谱，肿瘤组与SBPS组蛋白表达发生了改变的有18个，在SBPS组有6个蛋白点表达上调，1个蛋白点表达下调，1个蛋白点在SBPS组特异表达，10个蛋白点在SBPS组表达缺失。这些蛋白可能是癌基因或抑癌基因产物，或者部分蛋白可能是潜在的癌基因或潜在的抑癌基因产物，SBPS通过上调抑癌基因的表达、下调癌基因的表达，进而抑制肿瘤细胞的增殖或者诱导肿瘤细胞凋亡。SBPS组特有的蛋白质点所对应的蛋白质有可能是细胞出现的新的抑癌基因表达的产物，它们可能是SBPS作用的靶蛋白，由于SBPS的诱导表达发挥抗肿瘤增殖作用。

以上说明SBPS对肝癌的治疗是通过多靶点调节共同作用的，其对肝癌的治疗或许与改变这些蛋白质点的表达相关。已发现的这些差异或特异表达的蛋白质究竟是已知蛋白还是新蛋白，可通过质谱鉴定、氨基酸的序列分析和数据库检索等方法，还需要进一步确认。

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