黄鳝肉双酶水解产物的功能特性及其抗氧化活性*

韩林，丁博，王兆丹，汪开拓，郑红，郑海英

(重庆三峡学院生命科学与工程学院，重庆，404100)

黄鳝(Monopterus albus)，俗称:鳝鱼、鱓鱼、罗鳝，属辐鳍鱼纲，合鳃鱼目，合鳃鱼科，黄鳝属的淡水底栖肉食性鱼类［1］。黄鳝肉嫩味鲜，营养价值甚高，富含蛋白质、维生素等营养成分，具有补中益血，治虚损、咳嗽、湿热身痒等功效［2-3］。但目前，国内外对黄鳝肉酶解产物的功能性及抗氧化活性研究报道甚少。常用的酶主要有木瓜蛋白酶、碱性蛋白酶、胰蛋白酶、胃蛋白酶和组织蛋白酶等等，其中胰蛋白酶是由牛、羊、猪胰脏提取而得到的一种肽链内切酶，最适pH值为7.8～8.5，只能断裂赖氨酸或精氨酸的羧基参与形成的肽键。木瓜蛋白酶属巯基蛋白酶，具有较宽的底物特异性，作用于蛋白质中L-精氨酸、L-赖氨酸、甘氨酸和L-瓜氨酸残基羧参与形成的肽键，能切开蛋白质分子内部肽链-CO-NH-生成分子质量较小的多肽。碱性蛋白酶是一种最适作用pH为9～11的蛋白酶类，不但能水解肽键，还具有水解酯键、酰胺键和转酯及转肽的功能，对切开点羧基侧具有专一性。

本试验以淡水黄鳝肉为原料，采用木瓜蛋白酶、碱性蛋白酶、胰蛋白酶及双酶混合使用对其进行酶解，并检测了酶解产物的功能性和抗氧化活性，为黄鳝肉的深入研究和开发利用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料、药品与设备

黄鳝，购于重庆永辉超市。碱性蛋白酶(100 U/mg)，上海如吉生物科技发展有限公司;木瓜蛋白酶(1 000 U/mg)，上海如吉生物科技发展有限公司;胰蛋白酶(500 U/mg)，国药集团化学试剂有限公司;1，1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)，Sigma公司;2，2’-联氮-双-(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)(ABTS)，Amersco公司;甘氨酸，上海康达氨基酸厂;铁氰化钾、三氯乙酸、NaOH均为分析纯，购自广州化学试剂厂。

AL104电子分析天平，梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司;5417R冷冻离心机，德国eppendorf公司;ALPHA1-2/LD-Plus真空冷冻干燥机，德国CHRIST公司;HH-4数显恒温水浴锅，江苏省金坛市荣华仪器制造有限公司;UEC0905005紫外可见分光光度计，上海博普达仪器制造有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 黄鳝肉蛋白酶酶解产物的制备工艺

黄鳝肉→洗净→捣碎→与去离子水混合(质量体积比1∶10(g∶mL))→调温度、pH后加入蛋白酶酶解→灭酶(100℃，10 min)→离心(10 000 r/min，10 min)→取上清液→真空冷冻干燥→黄鳝肉蛋白酶解产物

其中酶解条件为:酶∶底物 =1∶500，(1)木瓜蛋白酶酶解时间240 min，pH 7.0，温度60 ℃;(2)碱性蛋白酶酶解时间240 min，pH 8.0，温度50℃;(3)胰蛋白酶酶解时间240 min，pH 8.0，温度37℃;(4)木瓜蛋白酶和碱性蛋白酶先后在各酶适宜的pH和温度下酶解120 min;(5)碱性蛋白酶和胰蛋白酶先后在各酶适宜的pH和温度下酶解120 min;(6)胰蛋白酶和木瓜蛋白酶先后在各酶适宜的pH和温度下酶解120 min。

1.2.2 水解度的测定

采用茚三酮比色法［4］。具体操作如下:配制不同浓度(20、40、60、80、100 μg/mL)的甘氨酸标准溶液，分别取1 mL，加入1 mL蒸馏水，充分混匀，再加入1 mL(质量浓度为0.5%)茚三酮溶液，混合均匀后置于沸水浴中加热15 min，取出立即冷却，然后用75%乙醇定容至10 mL，在波长570 nm测定吸光度，以甘氨酸质量浓度为横坐标，以吸光度为纵坐标绘制得到标准曲线为:y=0.001x+0.017，R2=0.996。

准确称取0.01 g各样品(氨基酸含量大约在20～100 μg)溶解于10 mL蒸馏水中，取1 mL按上述标准曲线的操作方法进行吸光度的测定，根据标准曲线计算样品中氨基酸的含量，以样品中氨基酸的含量表示水解度大小［5］。

1.2.3 抗氧化活性的测定

1.2.3.1 清除 DPPH 自由基的能力［6］

准确移取3.9 mL质量浓度为 25.61 mg/L的DPPH溶液，加入0.1 mL体积分数为70%的乙醇溶液，混匀，在波长517 nm处测吸光度Ac。将不同水解时间(0.5、1、2、3、4 h)得到的样品分别配制成浓度为5 mg/mL的溶液，准确移取2 mL，加入2 mL DPPH溶液(质量浓度为25.61 mg/L)，混合均匀，室温避光反应30 min后于波长517 nm处测定吸光度Ai。同时测定3.9 mL体积分数为70%的乙醇溶液中加入0.1 mL不同浓度各样品溶液的吸光度Aj。DPPH清除率为:

1.2.3.2 清除 ABTS 自由基的能力［7-8］

取5.0mL 7 mmol/L 的 ABTS 溶液，加入88.0 μL 140 mmol/L的过硫酸钾，在室温下置于暗处反应12～16 h，形成ABTS自由基储备液。在734 nm处，用体积分数70%的乙醇稀释ABTS自由基储备液，备用。不同水解时间(0.5、1、2、3、4h)得到的样品分别配制成浓度为5 mg/mL的溶液，准确移取2 mL，加入2 mL ABTS+溶液，混匀，在室温下反应6 min，于734 nm处测定吸光度 AE。同时吸取3.9 mL ABTS+溶液，加入0.1 mL体积分数70%的乙醇溶液于734 nm处测定吸光度 AB。ABTS自由基清除率按式(2)计算:

1.2.4 功能特性的测定

1.2.4.1 溶解性和热稳定性

根据李雪等的方法测定［9］。

1.2.4.2 乳化性［10］

准确称取各酶解产物0.1 g，溶于10 mL蒸馏水中，用0.2 mol/L的盐酸或氢氧化钠溶解调节至中性，在30℃的水浴中保温10 min，迅速加入等体积的大豆色拉油(10 mL)，充分混合均匀后，在2 500 r/min下离心5 min，按下载计算乳化能力:

2 结果与分析

2.1 水解度

黄鳝肉酶解产物水解度随时间的变化如图1所示。由图1可以看出，随着酶解时间的增加，单酶和双酶酶解产物的水解度逐渐上升，单酶中以胰蛋白酶酶解产物水解度上升较快，当酶解时间为4 h时，酶解产物氨基酸含量达40 μg/mL，而双酶酶解产物在2 h后，水解度上升较为显著，尤其是胰蛋白酶+木瓜蛋白酶组合，并且均高于单酶，这可能是由于所使用的木瓜蛋白酶和胰蛋白酶酶活相对较高，在相同时间内对黄鳝肉酶解更为彻底。因此，双酶酶解黄鳝肉更具有优势。

图1 黄鳝肉酶解产物水解度随时间的变化Fig.1 The effect of the time for the degree of the hydrolysis of hydrolysates from Monopterus Albus meat

2.2 抗氧化活性

2.2.1 DPPH·清除能力

黄鳝肉酶解产物对DPPH·的清除能力如图2所示。由图2可知，双酶酶解产物对DPPH·的清除能力显著高于单酶酶解产物，主要原因是双酶酶解黄鳝肉较单酶酶解彻底，产物中可能富含具有抗氧化活性的蛋白多肽，增强了其清除自由基的能力［11-12］。但随着酶解时间的增加(3 h后)，各酶解产物清除DPPH·的能力逐渐下降，可能是因为加热酶解时间过长，影响了蛋白多肽的抗氧化活性，这与黄条纹鲹蛋白酶解物及蚕蛹蛋白酶解物对DPPH·的清除规律相似［14-15］，但花生蛋白酶解物对DPPH的清除能力则随水解度的增加而增强［16］，这说明水解度对DPPH·清除能力的影响比较复杂，与蛋白质原料和蛋白酶种类有关。

图2 黄鳝肉酶解产物对DPPH自由基的清除能力Fig.2 The DPPH radical scavenging activity of the hydrolysates from Monopterus Albus meat

2.2.2 ABTS 自由基清除能力

由图3可知，黄鳝肉双酶酶解产物对ABTS自由基的清除能力显著高于单酶酶解产物，特别是胰蛋白酶+木瓜蛋白酶组合，最大清除率可达81.76%(酶解时间2h)，这与对DPPH自由基的清除现象相似。

2.3 功能特性

2.3.1 溶解性

不同条件下黄鳝肉酶解产物的溶解性如图4所示。可以看出，随着酶解时间的增加，酶解产物的溶解性逐渐增大，其中双酶酶解产物的溶解性普遍高于73%，显著高于单酶，特别是木瓜蛋白酶+碱性蛋白酶组合，酶解时间为4 h时，酶解产物溶解度达到96.14%。主要是因为双酶酶解使蛋白质大分子电离出更多的亲水基团和离子基团，其数量与蛋白质的水合作用程度有关［17］。

2.3.2 热稳定性

图3 黄鳝肉酶解产物对ABTS自由基的清除能力Fig.3 The ABTS radical scavenging activity of the hydrolysates from Monopterus Albus meat

图4 黄鳝肉酶解产物的溶解性Fig.4 The solubility of the hydrolysates from Monopterus Albus meat

热处理常常会使食品中的蛋白质分子发生构象变化和分子间的凝集，导致其功能特性降低，因此酶解产物的热稳定性是衡量其是否适用于食品加工的一个重要指标［18］。黄鳝肉酶解产物的热稳定性如图5所示。可以看出，黄鳝肉酶解产物经93℃处理10 min后溶解性均略有下降，但热稳定性仍然良好，其中双酶酶解产物热稳定性明显优于单酶酶解产物。

2.3.3 乳化性

乳化性是蛋白质重要的功能特性，对其用于食品乳化剂中具有重要的意义。蛋白质分子的乳化性主要受分子质量、疏水基团的数目以及蛋白质的弹性和分子结构等影响［17］。黄鳝肉酶解产物的乳化性如图6所示。随着酶解时间的增加，黄鳝肉酶解产物的乳化性均逐步下降，双酶酶解产物的乳化性下降尤为显著，主要原因是当水解程度过大时，水解产物中小分子的肽和氨基酸增多，不利于蛋白质在油-水界面的扩散和吸附，而形成具有适宜厚度和流变性的蛋白膜［19］。

图5 黄鳝肉酶解产物的热稳定性Fig.5 The heat stability of the hydrolysates from Monopterus Albus meat

图6 黄鳝肉酶解产物的乳化性Fig.6 The emulsibility of the hydrolysates from Monopterus Albus meat

3 结论

(1)黄鳝肉蛋白酶水解产物的水解度和抗氧化活性受酶解时间和蛋白酶种类的影响，其中双酶酶解产物抗氧化活性强于单酶酶解产物，其中胰蛋白酶+木瓜蛋白酶组合酶解产物抗氧化活性最强，对DPPH和ABTS自由基最大清除率可达62.18%和81.76%。

(2)黄鳝肉双酶酶解产物在溶解性和热稳定性方面优于单酶酶解产物，而在乳化性方面则较差，并且酶解时间对黄鳝肉酶解产物的功能性影响较大。当酶解时间为3h时，得到的酶解产物具有较好的抗氧化活性和功能性质，特别是胰蛋白酶+木瓜蛋白酶组合。因此，可以考虑取该条件下的酶解产物制备抗氧化活性多肽应用于食品工业。

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