高效液相色谱柱后衍生法测定鸡肉中的18种氨基酸

金明，牛宏亮，袁辉，赵煜

(甘肃省轻工研究院，甘肃兰州，730000)

鸡肉中富含蛋白质，而蛋白质的质量主要取决于氨基酸的组成和比例，尤其是必需氨基酸的组成和比例［1］。在目前仪器分析的领域中，禽肉类产品中多种氨基酸的分析方法的相关报道较少。最常用的分析方法有:氨基酸专用分析仪分析，高效液相色谱联合柱前衍生系统分析，高效液相色谱柱后衍生法分析等。但是氨基酸专用分析仪的价格昂贵，专属性强，仪器利用率低;高效液相色谱柱前衍生法分析自动化程度低、对柱子的损害大、前处理繁琐;而高效液相色谱柱后衍生法分析弥补了这些缺点——自动化程度高、衍生物的稳定性高、对柱子的损害小、前处理简单［2］，尤其在一些中小型实验室，能够实现液相色谱检测方法和液相色谱柱后衍生法之间的及时切换，提高了仪器的使用率。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

美国七彩山鸡肉，甘肃敦煌酒业有限公司提供。

18种氨基酸标准品:天门冬氨酸99.4%、苏氨酸99.1%、丝氨酸 99.6%、谷氨酸 98.9%、甘氨酸98.8%、丙氨酸99.4%、缬氨酸99.4%、半胱氨酸99.1%、蛋氨酸99.2%、异亮氨酸99.4%、亮氨酸99.5%、酪氨酸99.4%、苯丙氨酸99.9%、脯氨酸99.0%、组氨酸99.5%、色氨酸99.1%、盐酸赖氨酸99.2%、精氨酸99.0%，北京恒元启天化工技术研究院;TRIONE®茚三酮柱后衍生试剂(型号T100C、色谱纯)、酸性洗脱液Li275、中性洗脱液Li750、色谱柱再生液RG003等试剂，美国Pickering公司;石油醚(分析纯)天津科密欧化学试剂有限公司;HCl(优级纯)，北京化工厂。

1.2 仪器与设备

Agilent1200高效液相色谱分析仪(配有四元泵、紫外检测器和真空在线脱气机)，美国安捷伦科技有限公司;Pickering PCX柱后衍生仪(配有Pickering离子交换柱及Pickering PCX工作站)，美国Pickering公司;真空干燥箱(DZG-6050)，上海森信实验仪器有限公司;电热恒温干燥箱;数控超声波清洗器，上海科导有限公司;离心机，长沙湘仪仪器有限公司。

1.3 实验方法

1.3.1 混合氨基酸标准溶液的配制

根据各个氨基酸在色谱图上的响应值高低不同，为使它们的响应值在色谱图上一致，配制混标时，将各个单标的浓度配制在40～160 μg/mL内［3］。

1.3.2 样品处理

鸡肉需要取不同部位绞碎、称量2.0～5.0 g，采用石油醚索氏抽提4～6 h，除去样品中的脂肪，烘干。将样品转入到带塞的玻璃试管中加入6mol/L HCl，经抽真空充入氮气封住试管口，110℃烘箱内恒温水解24 h，取出放置冷却，将水解液用滤纸过滤到50 mL的容量瓶中用去离子水定容，再吸取1～2 mL于10 mL容量瓶内，50℃真空干燥后用去离子水定容，过 0.45 μm 膜，上机检测［4］。

1.3.3 色谱分析条件

离子交换柱:Lithium Ion-exchange Column，3.0 mm ×250 mm;保护住(Lithium Guard Column)，2.0 mm×2.mm，紫外检测波长570 nm;反应器温度，130℃;衍生试剂，茚三酮;衍生试剂流速0.30 mL/min;柱温，40℃;进样体积，10 μL。梯度洗脱条件:流动相流速0.32 mL/min，按表1中的条件进行梯度洗脱［5］

表1 流动相梯度洗脱程序Table 1 Mobile phase composition for the gradient elution program used in the chromatograph analysis

2 结果与分析

2.1 流动相的选择

本试验中选用的流动相为 Li275、Li750、RG003的梯度洗脱。Li275为酸性洗脱液，Li750为中性洗脱液，RG003为色谱柱再生液，全部由美国Pickering公司提供，使用该流动相时仪器响应信号较高。在这个流动相体系的梯度下洗脱，各个组分的分离比较好，得到满意的色谱图。

2.2 样品前处理方法

由美国 Pickering公司提供的 SERAPREP和URIPREP 2种样品前处理试剂对鸡肉类样品并不适用。通过实验证明，还是传统的将样品经过索氏抽提去除脂肪后再用HCl水解的方法比较实际，虽然时间较长，但是样品回收率比较高。

2.3 标准色谱图和鸡肉样品色谱图

图1 18种氨基酸的标准色谱图Fig.1 Chromatograms of 18 mixed standards amion acids

2.4 标准曲线和线性范围

图2 鸡肉自身样品中的18中氨基酸Fig.2 Chromatograms of 18 mixed amion acids in chicken sample

准确吸取已配制好的18种氨基酸的标准溶液2、4、8、10、20 μL 进样，以峰面积对浓度进行线性回归，绘制标准曲线。其中以天冬氨酸、缬氨酸、苯丙氨酸为例，其回归方程分别和相关系数分别为:Y=5.26e+004x+1.37e+002，r=0.999 2;Y=5.35e+004x-1.47e+003，r=0.999 0;Y=3.93e+004x+2.51e+002，r=0.999 5。表明18种氨基酸在8 ～80 μg/mL内线性关系良好。其他氨基酸的回归方程和相关系数见表2。

2.5 方法的精密度、重复性和回收试验

精密度试验:准确吸取18中氨基酸混标10μL进样，在上述色谱条件下重复进样6次，测定峰面积，其中以天冬氨酸、缬氨酸、苯丙氨酸为例，计算其RSD分别为0.87%、0.81%、0.95%(n=6)。

重复性试验:准确称取5份样品，按样品处理方法处理制备样品溶液，进样测定，记录峰面积，其中以天冬氨酸、缬氨酸、苯丙氨酸为例，计算其RSD分别为 1.2%、0.9%、1.1%(n=5)。

取已经测得含量的样品溶液，分别加入18种氨基酸混标溶液，0.5、1、2 mL，其中以天冬氨酸、缬氨酸、苯丙氨酸为例，测得其平均回收率和相关系数分别为:102.5%(RSD=1.15%)、92.4%(RSD=1.04%)、87.6%(RSD=0.94%)。

其他氨基酸的精密度、重复性和回收试验数据见表2。

表2 试验方法线性、精密度、重复性、回收试验数据表Table 2 linear，precision，repeatability，recovery of test method

2.6 七彩山鸡不同部位鸡肉中的氨基酸组成

按照上述1.3.2的样品处理方法和1.3.3的色谱条件，对七彩山鸡不同部位肉的18种氨基酸进行检测，结果见表3。

表3 七彩山鸡不同部位肉中18种氨基酸的含量Table 3 The content of 18 amino acid in different parts of chicken

从表3中得出:七彩山鸡鸡肉中18种氨基酸的平均含量为:天冬氨酸18.78 mg/g、苏氨酸9.96 mg/g、丝氨酸 9.16 mg/g、谷氨酸 10.28 mg/g、甘氨酸12.31 mg/g、丙氨酸11.71 mg/g、缬氨酸10.18 mg/g、半胱氨酸 2.48 mg/g、蛋氨酸 5.72 mg/g、异亮氨酸8.49 mg/g、亮氨酸 11.22mg/g、酪氨酸 9.05 mg/g、苯丙氨酸9.44 mg/g脯氨酸9.66 mg/g、组氨酸3.15 mg/g、色氨酸 6.14 mg/g、盐酸赖氨酸 8.97 mg/g、精氨酸10.91 mg/g，鸡腿肉中各个氨基酸含量水平最高。整个鸡肉中必需氨基酸(EAA)的含量为70.12 mg/g，氨基酸总量(TAA)为167.61 mg/g。非必需氨基酸(NEAA)含量为 97.49mg/g。EAA/TAA为41.84%，EAA/NEAA为0.72，分别超过WHO/FAO提出的EAA/TAA应为40%左右和EAA/NEAA应为0.6以上的参考蛋白质模式标准［6-8］。

2.7 七彩山鸡肉中与普通市售鸡肉样品中18种氨基酸含量的比较

经过计算，普通鸡肉中必需氨基酸(EAA)的含量为:57.96 mg/g，氨基酸总量(TAA)为:141.77 mg/g。非必需氨基酸(EAA)的含量为:83.81 mg/g。EAA/TAA为:40.88%，EAA/NEAA为0.69，分别超过WHO/FAO提出的EAA/TAA应为40%左右和EAA/NEAA应为0.6以上的参考蛋白质模式标准。但是都低于美国七彩山鸡肉中EAA/TAA和EAA/NEAA 的比值［9-10］。

表4 七彩山鸡肉和普通鸡肉样品中18种氨基酸含量对比数据表Table 4 The contrast data of 18 amino acid，content in colorful montain chicken and ordinayr chicken

3 结论

3.1 检测方法可行性

采用石油醚索氏抽提去除脂肪，6 mol/L盐酸水解样品。并且优化了色谱条件，采用Lithium Ion-exchange色谱柱(3.0 mm×250 mm)，流动相采用Li175、Li750、RG003的梯度洗本文研究了高效液相色谱柱后衍生法测定鸡肉中18种氨基酸的前处理方脱。以TRIONE茚三酮为柱后衍生试剂，检测波长为570 nm。试验方法的线性回归、精密度、重复性、回收率等试验都满足检测的要求。方法简便、快捷、准确，分离效果好，选择性高，检测灵敏度高，方法稳定，同时适用于其他各种肉类产品中18种氨基酸的检测。并且分析了鸡肉中氨基酸的种类和比例，EAA/TAA为:41.84%，EAA/NEAA为0.72，分别超过 WHO/FAO提出的EAA/TAA应为40%左右和EAA/NEAA应为0.6以上的参考蛋白质模式标准。

3.2 鸡肉样品中18种氨基酸的含量

分别对美国七彩山鸡肉和市售普通鸡肉中的18种氨基酸进行测定，根据试验数据，2种鸡肉中EAA/TAA和EAA/NEAA的比值分别都超过WHO/FAO提出的EAA/TAA应为40%左右和EAA/NEAA应为0.6以上的参考蛋白质模式标准。但是二者比之，七彩山鸡肉的EAA/TAA和EAA/NEAA的比值比普通市售鸡肉更高。

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