腐烂苹果中嗜酸耐热菌(Alicyclobacillus acidoterrestris)的分离鉴定及生长特性的初步研究*

马丽达，陈义伦，孙文静，魏然，吴茂玉，和法涛

(山东农业大学食品科学与工程学院，山东 泰安，271018)

酸土脂环酸芽孢杆菌(Alicyclobacillus acidoterrestris)，俗称嗜酸耐热菌［1］，易污染果汁产品，一般认为该菌来源于土壤［2］，通过落果、烂果、果皮、已感染的加工车间设备等传染到加工果汁中，并在加工过程中繁殖，以芽孢的形式耐受果汁加工过程中的巴氏杀菌，一旦遇到合适的萌发环境即大量繁殖代谢产生愈创木酚和卤酚，使得果汁口感风味变差，浊度升高乃至在包装物底部形成白色沉淀［3］。研究表明，酸土脂环酸芽孢杆菌是导致苹果汁酸败的主要菌种［4］。该菌在低污染时难以检出，产品流通及腐败时才会被发现［5］。

本研究以金帅腐烂果为材料，在分离嗜酸耐热菌并对其进行形态、生理生化及16S rDNA区鉴定的基础上，对其生长特性进行初步探索，以期为进一步完善嗜酸耐热菌的控制方法，提高苹果汁加工安全性提供理论和技术依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

1.1.1 菌株

金帅苹果:自然腐烂苹果。

标准菌:CICC 10374(=DSM 3922=ATCC 49025)由中国工业微生物菌种保藏中心提供。

1.1.2 培养基

(1)402 培养基:CaCl20.19 g，MgSO40.5 g，(NH4)2SO40.20 g，KH2PO43.0 g，酵母浸膏 2.0 g，葡萄糖 5.0 g，蒸馏水 1 000 mL，pH 4.0。

(2)K氏培养基:酵母浸膏2.5 g，蛋白胨5 g，葡萄糖 1 g，吐温80 1 g，琼脂15 g，蒸馏水1 000 mL，pH 4.0。

(3)LB培养基:酵母浸膏 5 g，蛋白胨 10 g，NaCl10 g，琼脂 15 g，蒸馏水 1 000 mL，pH 7.0。

(4)PDA斜面培养基:马铃薯200 g，蔗糖20 g，琼脂20 g，蒸馏水 1 000 mL，pH 4.0。

1.1.3 仪器与设备

PB-10pH计，Sartorius公司;电子显微镜YSZ-H，日本尼康光学仪器有限公司;PCR仪，Biometra Tcradient;凝胶成像系统，Upland.CA.USA;电泳仪DYY-8C，北京市六一仪器厂;数显恒温水浴锅 HH-I，国华电器有限公司

1.2 实验方法

1.2.1 菌种的分离、纯化与筛选

(1)菌种分离:挑取金帅苹果的腐烂部分，匀浆;称取10 g匀浆，加入90 mL无菌水进行悬浮;45℃、180 r/min 下振荡培养 30min，制成 10-1，10-2，10-3，10-4，10-5，10-6的稀释液，分别吸取 100 μL 涂布于402培养基上，45℃倒置培养3～4 d。挑取402培养基上生长的菌落形态类似于标准菌的疑似菌落，划线接种于LB平板上，45℃培养48 h，保留不能在LB平板上生长，但能在402培养基上生长的菌株，从而筛选出只能在酸性条件下生长的嗜酸菌株。将由此筛选出的嗜酸菌制成菌悬液;将此菌悬液在80℃条件下热处理10 min［6］，取0.1 mL菌液涂布于402培养基上，45℃培养48 h，观察是否有菌落出现，此时生长的菌种即为嗜酸耐热菌。

(2)菌种纯化:将分离得到的嗜酸耐热菌菌株在K氏培养基上进行平板划线纯化，45℃恒温条件下培养。按此方法连续划线，直至单个平板上为形态单一的菌落。挑取平板上的单菌落进行纯培养，得到纯菌株。

(3)菌种保藏:将纯菌株接种于PDA斜面培养基上培养24 h，4℃保藏备用。

1.2.2 菌种鉴定

(1)菌落形态及显微形态观察:将所得的菌种在K氏培养基上划线，进行菌落(形态，颜色，大小，边缘整齐度，透明度，黏稠度等)和显微镜观察。

(2)生理生化鉴定:根据《常见细菌系统鉴定手册》与《伯杰细菌鉴定手册》［7-8］对得到的细菌进行生理生化鉴定。主要指标包括碳源利用、氧化酶试验、接触酶试验、V-P试验、明胶液化试验、淀粉水解试验、吲哚试验、脲酶试验。

(3)分子生物学鉴定

a.DNA的提取。将菌种接种在K氏液体培养基中，45℃，180 r/min摇床培养14 h，然后用细菌基因组DNA提取试剂盒提取菌株的DNA。

b.PCR扩增。扩增使用的上游引物为27F，下游引物为1492R。

27F:5＇-AGAGTTTGATCCTGGTCAGAACGAACGCT-3＇;

1492R:5＇-TACGGCTACCTTGTTACGACTTCACCCC-3＇。

PCR扩增的反应体系为50 μL，其中10×buffer 5 μL;Mg2+3 μL;dNTP 4 μL;引物各 1 μL;Taq 酶 0.4 μL;模板2 μL;双蒸水补足到 50 μL。PCR 扩增的反应条件为:95℃预变性5 min，94℃变性1 min，58℃退火30 s，72℃延伸1 min 30 s，进行35个循环，最后72℃保温10 min。4℃保藏。

将PCR扩增产物送华大测序公司进行测序。测序结果在软件DNAMAN上进行拼接，拼接结果在NCBI上进行BLAST比对，构建系统发育树。

1.2.3 生长特性的研究

(1)生长曲线的绘制:将各菌株的活化液分别接种在K氏液体培养基中，45℃、180 r/min摇床培养。并于接种后的第 0、2、4、6、8、10、12、14、16、18、20 和24 h，以未接种菌种的空白K氏液体培养基作为空白，取菌液于1 cm比色杯利用分光光度计测定600 nm处的吸光度，绘制出各菌株的生长曲线。

(2)温度对菌株生长的影响:将各菌株接种在K氏液体培养基中在不同的温度(20、25、30、35、40、45、50、55、60、65℃)条件下进行摇瓶培养，45℃、180 r/min摇瓶培养16 h后，以未接种菌种的空白K氏液体培养基作为空白，取菌液于1 cm比色杯利用分光光度计测定600 nm处的吸光度，得出菌株在不同温度条件下的生长情况。

(3)pH对菌株生长的影响:将各菌株在不同pH值(2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0)的K氏液体培养基中进行摇瓶培养，45℃、180 r/min摇瓶培养16 h后，以未接种菌种的空白K氏液体培养基作为空白，取菌液于1 cm比色杯利用分光光度计测定600 nm处的吸光度，得出菌株在不同pH条件下的生长情况。

(4)芽孢耐热性:参考焦中高［9］的方法，将芽孢悬液稀释至105～106CFU/mL，然后置于90℃水浴中处理，分别取一定量的处理悬液稀释涂平板，40℃培养3 d后计数。以处理时间为横坐标、存活芽孢数的对数为纵坐标进行线性回归，作芽孢存活曲线，计算D90℃值。D90℃值即该菌株芽孢在90℃处理时存活曲线斜率的负倒数。

2 结果与分析

2.1 嗜酸耐热菌的确定

从腐烂苹果中通过分离、筛选及纯化，最终得到2株嗜酸耐热菌，即分离菌A-1和分离菌A-2，如图1与图2所示。

图1 A-1菌落形态图Fig.1 Colonial morphology of strain A-1

图2 A-2菌落形态图Fig.2 Colonial morphology of strain A-2

A-1、A-2经过 80℃、10 min的热处理，均可在402培养基上生长良好，表明有很好的耐热性;另外均可在K氏培养基上生长良好，但在LB培养基上不能生长，表明2株分离菌具有耐酸性，初步确定A-1、A-2均为嗜酸耐热菌。

2.2 形态学鉴定

经形态学观察(图1-图4)可知，2株分离菌与标准菌的菌落形态特征及显微形态特征十分相似，其形态描述如表1。

图3 A-1革兰氏染色图Fig.3 Micrograph of strain A-1 by Gram stain

图4 A-2革兰氏染色图Fig.4 Micrograph of strain A-2 by Gram stain

表1 形态学特征Table 1 Morphological characteristics

2.3 生理生化鉴定

分离菌A-1、A-2进行生理生化试验的结果如表2所示。A-2氧化酶呈阴性，A-1的肌醇利用呈阴性，其他生理生化指标均与标准菌相同，同种微生物不同菌株间可能存在特性的差异，分离菌与标准菌仍具有同属脂环酸芽孢杆菌属的可能性。

表2 生理生化鉴定结果Table 2 Results of physiological and biochemical identification

通过对菌种的形态观察和生理生化鉴定，可以得知2株分离菌与标准菌的各项指标相似，初步认为2株分离菌均属于脂环酸芽孢杆菌属。对分离的2株菌进行分子生物学分类鉴定，进一步确定其分类地位。

2.4 分子生物学鉴定

2.4.1 序列比对结果

利用细菌试剂盒提取2株分离菌的DNA，电泳检测后进行PCR扩增，将PCR扩增产物进行测序。分离菌的DNA及PCR产物电泳图见图5，由图5可知，PCR产物扩增之后得到的序列长度均在1 500 bp左右。

图5 DNA及PCR产物电泳图Fig.5 DNA electrophoresis and PCR product electrophoresis

2.4.2 系统发育树的构建

PCR产物测序结果在DNAMAN上进行拼接，并在GENEBANK上进行BLAST比对，挑选同源性超过99%的基因序列构建系统发育树(见图6)。由系统发育树可知，该菌与酸土脂环酸芽孢杆菌的同源性可达到100%，结合形态鉴定和生理生化鉴定结果，最终鉴定A-1、A-2均为酸土脂环酸芽孢杆菌。

图6 分离菌A-1与A-2的系统发育树Fig.6 Phylogenetic tree of isolated strains A-1 and A-2

2.5 生长特性的研究

2.5.1 生长曲线的绘制

由图7可知，A-1与标准菌的生长趋势大致相同，均在4h时由延迟期进入对数生长期，8 h时进入稳定生长期;当生长到16 h之后菌体浊度缓慢降低。而A-2生长速度较快，培养14 h之后营养物质消耗殆尽，菌体浊度缓慢降低。

图7 菌株生长曲线Fig.7 Growth curves of standard and isolated strains

2.5.2 温度对菌株生长的影响

菌株分别在不同温度下培养16 h，测定OD600。由图8可以看出，A-1、A-2均可在一个相对广泛的温度范围内生长。当pH为4.0时，温度为45℃，A-1、A-2菌体浊度最高，长势最好，可确定为A-1、A-2的最适生长温度。

Wisotzkey［10］提出细胞膜中独特的ω-环己烷脂肪酸结构为脂环酸芽孢杆菌在酸热环境中的生长提供有利条件。ω-环己烷脂肪酸作为细胞的保护结构，有助于提高细菌处于高温环境和酸性条件的适应能力和生存能力。目前脂环酸芽孢杆菌的耐热机制尚不明确，仍需进一步的深入研究与探讨。

2.5.3 pH值对菌株生长的影响

图8 温度对菌株生长的影响Fig.8 Effect of temperature on strain growth

菌株在不同pH值条件下分别培养16 h，测定OD600。由图9可以看出，A-1、A-2生长的pH范围为2.5～6.5。当pH值为3.5时，A-2菌体浊度最高，长势最好，为A-2的最适生长pH值。当pH值为4.0时，A-1菌体浊度最高，长势最好，为A-1的最适生长pH值。

图9 pH值对菌株生长的影响Fig.9 Effect of pH on strain growth

从2株分离菌的生长pH值范围和最适生长pH可以看出，分离菌表现出了对酸性条件的嗜好性，能较好的耐受酸性条件。因此，只有在酸性条件下该菌才适宜生长繁殖。

2.5.4 芽孢耐热性的研究

嗜酸耐热菌芽孢90℃热处理，其存活曲线如图10所示。A-1、A-2的 D90℃分别为11.90 min和13.70 min。A-2的芽孢表现出了比标准菌(D90℃约为13.33 min)更强的耐热性。

图10 芽孢存活曲线Fig.10 Survival curves of spores

嗜酸耐热菌的耐热性主要体现在芽孢上。在苹果汁加工过程中，巴氏杀菌或高温瞬时灭菌并不能使其芽孢失活，反而刺激了芽孢的萌发。待条件适宜时芽孢可在苹果汁中大量繁殖最终导致苹果汁的腐败。

3 结论

(1)本次实验经形态学特征、生理生化特性验证得到了2株与标准菌A.acidoterrestris CICC 10374具有明显相似性的嗜酸耐热菌A-1与A-2，经16S rDNA序列比对并构建系统发育树，分离菌与A.acidoterrestris同源性可达100%，最终分离菌A-1、A-2均鉴定为酸土脂环酸芽孢杆菌。

(2)从腐烂的金帅苹果中分离到的酸土脂环酸芽孢杆菌A-1、A-2的最适生长温度均为45℃(pH值为4.0)，最适生长pH值分别为4.0、3.5。90℃热处理其芽孢，A-1、A-2的D90℃分别为11.90 min和13.70 min，A-2比A-1、标准菌有更强的耐热性，A-2可作为苹果汁加工过程品质控制的主要对象进一步研究。

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［10］ Wisotzkey J D，Jurtshuk P，Fox G E，et al.Comparative sequence analyses on the 16S rRNA(rDNA)of Bacillus acidocaldarius，Bacillus acidoterrestris，and Bacillus cycloheptanicus and proposal for creation of a new genus，Alicyclobacillus gen.nov［J］.International Journal of Systematic Bacteriology，1992，42(2):263-269.