静脉和吸入麻醉后认知功能障碍与BACE1基因多态性的关系

蔡英敏，张 勇，胡海涛，张蓬勃，李 兰，舒粉宁(西安交通大学第二附属医院麻醉科，西安 710004;通讯作者，E-mail:roryzhang@126.com)

大量研究表明［1］，某些全麻药能使诱发老年痴呆的物质Aβ生成加速;而老年痴呆和遗传有着密切的关系，其中β分泌酶基因就是一个与老年痴呆密切相关的基因之一。临床观察发现，全麻后认知功能障碍如果没有得到及时、有效的治疗，会演变为长期认知功能障碍，进而导致老年痴呆的发生。因此我们假设:全麻后认知功能障碍与某些全麻药有密切关系，且与遗传有一定的相关性。为此，我们设计了这个病例控制性研究，旨在探索全麻后认知功能障碍与麻醉药的种类及与患者自身某些遗传因素方面的关系。

1 材料与方法

1.1 分组及纳入标准

本研究为病例控制、区段随机分组的临床实验，受试者为西安交通大学第二附属医院的外科手术患者(神经外科因手术本身会对患者认知功能造成影响，因此被排除在外)，无精神病史及家族史。(基因多态性的分析需要大量样本，因此需要很长时间收集样本，这种研究的结果无论是阳性还是阴性都很有意义。)从2005-2012年总共有ASAⅠ-Ⅱ级择期无血缘关系老年手术患者1 000例，平均年龄(70.2±5.1)岁，接受全身麻醉并被列为受试对象。所有患者术前均由临床神经科医师根据Folstein简易精神状况检查法(mini mental state examination MMSE)［2］进行智力检测，以剔除有痴呆症状表现的患者。根据受试者进入临床试验的时序分为8个区段，再对每个区段随机化分为静脉麻醉组和吸入麻醉组两组(各500例)。两组病人年龄、体重、性别、民族、手术种类等基线数据无显著性差异(P＞0.05，见表1)。本实验中麻醉师实施麻醉，麻醉助手进行术后随访，患者本人及随访者不知分组情况。本研究经西安交大第二附属医院伦理委员会批准。所有患者术前均签署麻醉知情同意书和麻醉、精神药品使用知情同意书。

表1 静脉麻醉组和吸入麻醉组患者的基线数据Table 1 Com parison of baseline data between intravenous anesthesia group and inhalation anesthesia group

1.2 麻醉方法

所有患者麻醉前30 min常规肌肉注射地西泮10 mg，阿托品0.5 mg，进入手术室后开放静脉通路，连接三路输液导管。

静脉麻醉组患者:三根TCI泵导管分别用于输注芬太尼、丙泊酚和肌松剂维库溴铵。设定芬太尼的靶浓度为 5.12 ng/ml，丙泊酚的靶浓度为 3 μg/ml，分六步给药:起始靶浓度为 1 μg/ml，每次浓度增加0.4 ng/ml，间隔150 s;维库溴铵的靶浓度为2.0-2.5 μg/ml。给药顺序为先启动芬太尼 TCI泵，15 min后启动丙泊酚TCI泵，22 min后启动维库溴铵TCI泵。在此期间先给予面罩给氧监测血氧饱和度，当患者呼吸停止后，行加压面罩给氧;当BIS值到达40-60，肌松TOF比值到达10%-20%时，进行气管插管。气管插管成功后，行桡动脉置管，监测有创动脉压;行颈内静脉置管术，用于监测中心静脉压和输血补液(因为受试者为老年患者，有创动脉压和颈内静脉是基本的监测手段以确保安全)。术中全凭静脉维持麻醉深度，根据生命体征、BIS、心率变异性(HRV)、肌松监测调节上述三种药物的靶浓度。

吸入麻醉组患者:按2 mg/kg丙泊酚静脉注射，速度为4 mg/s，待病人意识消失时静脉注射维库溴铵0.08 mg/kg，行加压面罩给氧，当 BIS值、肌松TOF比值同静脉麻醉组时进行气管插管，术中吸入异氟醚维持麻醉，根据与静脉麻醉组相同的监测参数调节异氟醚吸入浓度。术中按照晶体与胶体3∶1的比例补充复方氯化钠与羟乙基淀粉。

1.3 认知功能评价

术前与术后3 d内相同时间点记录MMSE评分，评价患者认知功能的变化。

1.4 SNPS 位点查询

在NCBI网站查找BACE1和BACE2基因的SNPS位点。

1.5 基因组DNA的提取

所有患者于麻醉前采取血样本3 ml于EDTA抗凝剂(1 mg/ml)中，放入超低温冰箱备用。

按照说明书进行基因组DNA的提取、浓度测定和质量检测［3］。

DNA的保存:基因组DNA溶于TE缓冲液，-20℃保存备用。

引物设计:BACE1基因引物:上游引物5’-TTA TGT TCC CAG GCT CTC CCT TG-3’，下游引物 5’-ACT CAC TCT CCT TCT GTG CCA CCA G-3’。

BACE2基因引物:上游引物5’-CAT AAA CCT CCA TCT ACC TGA CAT A-3’，下游引物5’-CAG CAT TAT TGT GGT GAT AGA G-3’。

3）当流量为40～60m3/h（标准状态下）时，功率应采用大于70kW，而当流量为30m3/h（标准状态下）时，功率应采用50～60kW，一般情况下尽量不采用40kW的功率。

PCR扩增反应体系:BACE1 12 μl(包括Mix 6 μl;primer各 1.0 μl;H2O 2.5 μl;样本 2.0 μl);BACE2 11 μl(包括 Mix 6 μl;primer各 1.0 μl;H2O 2.5 μl;样本 1.5 μl)。

反应条件:BACE1，95℃预变性5 min，94℃45 s、58 ℃45 s、72 ℃60 s 30 个循环，72 ℃延伸20 min。BACE2，95 ℃预变性5 min，94 ℃45 s、62 ℃30 s、72℃30 s 30个循环，然后72℃延伸10 min。

按说明书方法进行聚丙烯酰胺凝胶电泳［3］。

1.6 统计学分析

MMSE评分均数采用t检验，基因频率采用基因计数法，基因型及基因频率比较采用χ2检验。统计软件为STATA4.0医学统计软件。

2 结果

2.1 两组病人MMSE评分均数

静脉麻醉组患者术前、术后MMSE评分均值均高于25，而吸入组患者术后3 d的MMSE评分较术前及静脉组同时间的MMSE评分均明显降低(P＜0.05，见表2)。

2.2 静脉和吸入麻醉患者BACE1基因频率分布的比较

由表3可见随机分入静脉麻醉组和吸入麻醉组病人的BACE1基因频率分布无明显差异。

表2 静脉麻醉组和吸入麻醉组病人MMSE评分均数(±s)Table 2 The MMSE of patients in intravenous group and inhalation group(±s)

表2 静脉麻醉组和吸入麻醉组病人MMSE评分均数(±s)Table 2 The MMSE of patients in intravenous group and inhalation group(±s)

与术前比较，*P ＜0.01;与静脉麻醉组比较，#P ＜0.01

组别 术前 术后第1天 术后第2天 术后第3天静脉麻醉组 27.34 ±1.24 25.75 ±2.21 26.89 ±1.67 26.89 ±2.01吸入麻醉组 27.67 ±1.12 16.69 ±3.61*# 19.21 ±2.06*# 21.48 ±3.06*#

表3 静脉麻醉和吸入麻醉组患者BACE1基因的频率分布 (%)Table 3 The frequency distribution of BACE1 genotypes in intravenous group and inhalation group (%)

2.3 吸入麻醉组中不同MMSE评分组患者BACE1基因频率的分布

将500例吸入麻醉组患者按照MMSE评分分为MMSE＜25分组和MMSE＞25分组，由表4可知有320例MMSE＞25被分入吸入1组，180例MMSE＜25被分入吸入2组中。吸入2组中G/G基因型频率最高，G/C型次之，C/C型最少。经检验，吸入2组G等位基因(Z=3.92，P＜0.05)和 G/G 基因型(Z=4.03，P＜0.05)均高于吸入1组。而吸入2组C等位基因和C/C基因型与吸入1组比较，差异无统计学意义。

2.4 静脉组中不同MMSE评分组患者BACE1基因频率的分布

表4 吸入麻醉组中不同MMSE评分组患者BACE1G基因及G/C基因型频率的分布 (%)Table 4 Frequency distribution of BACE1 genotypes in different MMSE patients in inhalation group (%)

表5 静脉麻醉组中不同MMSE评分组患者BACE1G基因及G/C基因型频率的分布 (%)Table 5 Frequency distribution of BACE1 genotypes in different MMSE patients in introvenous group (%)

2.5 静脉和吸入麻醉两组病人BACE2基因频率的分布

由表6可见随机分入静脉麻醉组和吸入麻醉组患者的BACE2的基因频率分布无明显差异。

表6 静脉麻醉和吸入麻醉两组患者BACE2T等位基因及T/C基因型频率多态的频率分布 (%)Table 6 Frequency distribution of BACE2 genotypes in inhalation group and intravenous group (%)

2.6 吸入组中不同MMSE评分组患者BACE2基因频率的分布

由表7可见吸入1组(MMSE＞25)和吸入2组(MMSE＜25)不同患者BACE2等位基因及基因型频率分布的差异没有统计学意义。

2.7 静脉组中不同MMSE评分组患者BACE2基因频率的分布

由表8可见静脉1组(MMSE＞25)和静脉2组(MMSE＜25)两组患者的BACE2等位基因及基因型频率分布的差异没有统计学意义。

表7 吸入麻醉组中不同MMSE评分组中患者BACE2T等位基因及T/C基因型频率的分布 (%)Table 7 Frequency distribution of BACE2 genotypes in different MMSE patients in inhalation group (%)

表8 静脉麻醉组中不同MMSE评分组患者BACE2T等位基因及T/C基因型频率的分布 (%)Table 8 Frequency distribution of BACE2 genotypes in different MMSE patients in intravenous group (%)

3 讨论

静脉麻醉或吸入麻醉都是目前临床上广泛应用的麻醉方法，目前我们还是把大量的精力放在怎样维持术中生命体征的平稳上，而对术后患者认知功能的恢复缺乏足够的关注。

在临床实践中，我们注意到即使不存在已知的危险因素，仍有一部分患者出现了术后认知功能障碍。我们认为一定还有其他一些因素未被发现。

在因老年痴呆而死亡患者的大脑病理切片中发现的淀粉样蛋白沉积是诊断此病典型的病理特征，在形成淀粉样蛋白的通路上，β-淀粉酶是一个关键酶［5］。已有研究表明BACE1的多态性与ApoEε4型老年痴呆显著相关，但在不同国家、不同种族人群的研究结果不尽相同［6］。

由于全身麻醉后出现认知功能障碍的老年患者越来越多，我们假设携带BACE基因的患者较其他人更易出现神经生理功能的紊乱。基于这个假设，我们设计了一个病例控制性研究。在实验中，患有严重的心、肺疾病或肝、肾功能不全的患者被排除于实验之外，患有痴呆的老年病人也被排除。剔除这部分病例的原因是:如果将他们纳入实验组，我们将无法判断术后认知功能障碍是疾病本身引起的，还是全身麻醉诱发的，在统计学中，它应被视为一种混杂因素而剔除。实验中两组患者的基本条件没有统计学差异。

麻醉药引起的脑代谢紊乱被认为是诱发术后认知功能障碍的一个基本机制［7］。为了确保患者的安全，研究中使用的麻醉药物应该是在临床中应用广泛或有较长的应用历史。在本实验中进行比较的两种麻醉剂:吸入麻醉剂异氟醚和静脉麻醉剂丙泊酚是世界范围内应用最为广泛的两种麻醉剂，因此被选为实验药品。

本研究首次揭示了在接受吸入麻醉或静脉麻醉的老年患者中出现的术后认知功能障碍和BACE1 G/G基因型的关系。我们测量了两组患者BACE1和BACE2的基因型。通过对两组病人BACE1和BACE2基因频率分布的分析，首先排除了随机分入两组的患者基因频率分布的差异性。结果 显示随机分入两组病人的BACE1和BACE2的基因频率分布无明显差异。通过分析吸入麻醉组中不同MMSE评分组患者BACE1基因频率的分布，提示G/G基因型与吸入麻醉术后MMSE的降低的关系应该受到关注。

我们研究发现随机分配入静脉麻醉组和吸入麻醉组的两组患者中，BACE1 G基因型和等位基因频率无明显差异，而术后出现认知功能障碍的患者数量差异明显。在静脉麻醉组中，出现认知功能障碍的患者数量少，MMSE评分均在20-25分之间，无永久性认知功能障碍的患者。这些患者与本组评分在25分以上的患者之间基因型和等位基因频率无明显差异。说明全凭静脉麻醉对老年人长期的认知功能没有明显影响，MMSE评分的高低与BACE1单核苷酸多态性无明显相关性。在吸入麻醉组中，认知功能障碍患者的数量与静脉组有明显差异，在不同评分组的患者中BACE1基因型和基因频率出现差异，在MMSE评分较低一组中BACE1 G等位基因和G/G基因型频率出现较多，在BACE1 G等位基因与气体麻醉组中MMSE评分的关联性分析中，提示BACE1 G等位基因可能是老年患者接受气体麻醉后出现认知功能障碍的一个危险因素。

本研究中吸入麻醉组患者的认知功能障碍主要出现在术后3 d，提示这两种麻醉方法都没有导致长期的认知功能障碍。但是在吸入麻醉组中，尤其是携带BACE1 G等位基因的患者出现术后短期认知功能障碍的机会要大于静脉麻醉组。虽然这种短期的认知功能障碍短期内得以恢复，我们也不能就因此认为在患者脑内的某些区域没有任何形态学或生理、生化方面的改变。一项新近的研究发现［8］:将大鼠暴露于浓度低于2%的异氟醚中仅2 h，就能增加脑内Aβ的含量。因此我们认为吸入性麻醉药对人脑有一种潜在的危害，至少对携带某些基因的老年患者如此。至于这种危害是否长期存在于脑内，需要进一步的研究加以证实。

在本研究中静脉麻醉、吸入麻醉两组中BACE1基因多态性成随机分布，差异没有显著性意义，在静脉麻醉组中不同评分的两组BACE1基因的多态性的差异也没有统计学意义;但在吸入麻醉组中，评分低的一组与BACE1基因G/G基因型和G等位基因关联显著，因此我们有理由把BACE1的多态性看成可能是诱发老年性痴呆的一个危险因素。

BACE2为 BACE1的同源物［9］。518个氨基酸组成BACE2［10］，结构和 BACE1类似，亦含有 N端的信号序列、前蛋白质区、成熟蛋白催化区和C端延伸区。BACE2在109-112和300-303处含有2个天冬氨酸蛋白酶活性区域，2个N-糖基化位点和6个半胱氨酸残基，这些残基的位置与BACE1很接近，具有和BACE1极为相似的三级结构［10］。近年来，研究证实淀粉样β淀粉样分泌酶BACE1和BACE2为两种具有β2分泌酶活性的天冬氨酸蛋白酶［11］，它们均可在体外发生 APP的 β 酶解作用。21q22.3区域是编码BACE2蛋白基因所在区域，而这个区域内可能存在迟发性AD的易感基因。研究BACE2基因与AD发病风险关系的结果未能证实BACE2基因多态在AD发病风险中的作用，只是在个案报道中发现与家族性老年痴呆相关的BACE2基因的多态性。我们研究的结果显示:不论静脉麻醉组还是吸入麻醉组，在不同MMSE评分的人群中，BACE2基因的多态性没有显著性差异。说明这个基因多态性与散发的老年性认知功能障碍无相关性。这个结果从另一方面支持它可能是与家族性老年痴呆相关的基因。

本研究主要观察静脉麻醉和吸入性麻醉两种不同的麻醉方式以及BACE1及BACE2基因多态性与术后认知功能障碍发生的关系。在本研究中静脉麻醉的代表药物是丙泊酚，吸入麻醉的代表药物是异氟醚。但是，临床上应用的静脉和吸入麻醉药物还有很多种，在一项研究中无法一一列举。老年人术后认知功能障碍的发生与其他麻醉药物的应用有什么样的关系，需要进一步深入研究。

基因多态性受地域、种族等因素影响较大，本研究对象主要是西北地区的汉族人群，因此研究结果有它的局限性。如果能有不同民族、不同地域的多中心研究，结果将更具有普遍意义。

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