复发性口腔溃疡大鼠模型免疫功能与血清因子的变化分析＊

西安医学院口腔医学系口腔修复正畸学教研室 （西安710021）

周 芳 李 东▲ 王丹杨△ 郭 娜＃ 王 琳＃ 左艳萍

复发性口腔溃疡是临床上常见的口腔黏膜病。复发性口腔溃疡的诱因主要为局部创伤、精神紧张、食物、药物、激素水平改变等，而感染因素、系统性疾病因素及环境因素等对复发性口腔溃疡的发生发展起到重要作用［1，2］。对于免疫因素来说，复发性口腔溃疡患者存在细胞免疫功能下降和T淋巴细胞亚群失衡，表明人类复发性口腔溃疡的发生与自身免疫相关［3］。血清因子是影响患者机体状况的重要因素，其中血清氧自由基在复发性口腔溃疡活动期及恢复期的发生中有重要作用。但这些细胞因子及免疫系统在复发性口腔溃疡中的作用及机制目前尚处在探索阶段。本文为此通过动物实验分析了复发性口腔溃疡大鼠模型免疫功能与血清因子的变化，希望为分析复发性口腔溃疡的发生与发展机制提供参考。

材料与方法

1 实验材料 SD清洁级大鼠60只，雄性30只，雌性30只，体重180～200g，由西安交通大学医学院实验动物中心提供。超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽过氧化物酶（GSHPX）和丙二醛（MDA）等试剂盒来自南京建成生物工程研究所，完全费氏佐剂来自美国Sigma公司，生理盐水、PBS缓冲液、蒸馏水、无水乙醇、二甲苯等来自本实验室；兔抗鼠CD4单克隆抗体和兔抗鼠CD8单克隆抗体来自美国Beckman Coulter公司；左旋咪唑来自武汉合中化工制造有限公司。

2 实验设备 高速离心机由北京京立离心机有限公司生产、组织匀浆器由南京建成生物工程研究所生产、流式细胞仪购自美国Beckman Coulter公司、可见光分光光度计购自上海精密科学仪器有限公司、生物组织石蜡切片机购自沈阳誉德电子仪器有限公司。

3 实验方法

3．1 动物分组：将60只SD清洁级大鼠随机均分为正常对照组、模型组及左旋咪唑组3组，每组20只，雌雄平分，体重也为180～200g。所有大鼠同室分笼饲养，严格按照动物实验中心的要求进行操作，饲养1周适应实验室环境后开始进行实验。

3．2 动物造模：将大鼠麻醉后剥取口腔黏膜，加入0．1mol／L，pH7．4的PBS缓冲液制成组织匀浆。免疫动物时，将组织匀浆与弗氏佐剂等比例混合，严格按照说明书操作制成抗原乳化剂。将模型组和左旋咪唑组的大鼠脊柱两侧剪去鼠毛，碘伏消毒后每侧皮下注射0．1ml抗原乳化剂，每周注射1次，注射周期为3次。观察大鼠口腔黏膜变化，没有注射抗原大鼠为正常对照组。经过观察，在第3次注射抗原乳化液1周后所有大鼠模型均出现口腔溃疡，而正常对照组大鼠的口腔则未有明显的变化。同时手术刀片切取模型组口腔溃疡黏膜组织及正常对照组大鼠的口腔黏膜组织，进行病理观察。

3．3 给药方法：在口腔溃疡模型制作完成后进行给药，正常对照组及模型组大鼠均给予正常饮食水，左旋咪唑组采用20mg／kg剂量灌胃，以上给药或给谁均每日1次，共治疗30d。

3．4 样本采集：正常对照组和模型组于第3次注射免疫1周后出现口腔溃疡后采集外周血，于用药后第30天对左旋咪唑组进行采集。从各组大鼠眼眶采血，常规抗凝后离心，取上清的血清，装入高温已灭菌的EP管，－70℃冰箱中保存待测。

4 观察指标 密切观察并记录模型组及左旋咪唑组大鼠发生溃疡的持续时间、数目及间隔时间。同时采用直接免疫荧光标记全血溶血法流式细胞仪检测CD3与CD4的表达情况，采用黄嘌呤氧化酶法检测SOD活性，采用硫代巴比妥酸法检测MDA含量。

5 统计学方法 采用SAS12．0软件对数据进行统计学分析，数据采用±s表示，对比采用LSD－t检验，P＜0．05代表差异显著。

结 果

1 溃疡相关指标对比 经过观察，模型组大鼠发生口腔溃疡的数据明显多于左旋咪唑组大鼠发生溃疡的数目，同时溃疡间隔时间延长、持续时间缩短，两组对比差异明显，有统计学意义（P＜0．05），见表1。

表1 不同组别溃疡持续时间、发生数目及间隔时间的变化（±s）

表1 不同组别溃疡持续时间、发生数目及间隔时间的变化（±s）

注：与对照组相比＊P＜0．05

组 别 n 溃疡数目 持续时间 间隔时间（d）20 19．25±3．12 3．00±0．64 2．05±0．16左旋咪唑组 20 9．63±3．00＊2．21±0．55＊ 8．80±0．20模型组＊

2 T淋巴细胞亚群的变化 经过观察，与对照组相比，模型组的大鼠外周血中的CD4＋细胞比例明显降低，而左旋咪唑组的大鼠外周血中的CD4＋细胞比例高于模型组，对比差异有统计学意义（P＜0．05）；3组的大鼠外周血中的CD8＋细胞比例对比差异都无统计学意义（P＞0．05），见表2。

表2 不同组别外周血中T淋巴细胞亚群的变化（%，±s）

表2 不同组别外周血中T淋巴细胞亚群的变化（%，±s）

注：与对照组相比＊P＜0．05，与模型组相比＃P＜0．05

组 别 n CD4＋ CD8＋20 49．50±3．52 19．62±3．40模型组 20 41．43±4．63＊ 17．68±2．36左旋咪唑组 20 55．89±4．00＃对照组20．27±2．99

3 血清因子的变化 经过观察，与对照组相比，模型组的大鼠血清中SOD活性降低，MDA含量升高，对比差异都有统计学意义（P＜0．05）。左旋咪唑组与模型组相比，大鼠血清中SOD活性升高，MDA含量降低，对比差异有统计学意义（P＜0．05），见表3。

表3 不同组别血清SOD和MDA的变化（±s）

表3 不同组别血清SOD和MDA的变化（±s）

注：与对照组相比＊P＜0．05，与模型组相比＃P＜0．05

组 别 n SOD（U／ml） MDA（nmol／ml）20 328．62±40．58 5．58±0．18模型组 20 230．50±51．23＊ 8．26±0．21＊左旋咪唑组 20 230．25±45．36＃ 8．10±0．19对照组＃

讨 论

复发性口腔溃疡是最常见的口腔黏膜病，临床表现为口腔黏膜反复出现孤立的圆形或椭圆形的浅表溃疡，有自愈性、周期性、复发性的特点。其中免疫、遗传和环境可能是复发性口腔溃疡发病的“三联因素”［4］。

研究表明复发性口腔溃疡会造成患者的淋巴细胞功能降低及T淋巴细胞亚群失衡，其中T淋巴细胞亚群异常对复发性口腔溃疡的发生发展有重要作用［5］。其中T淋巴细胞按其功能可分为CD8＋和CD4＋两个亚群，其中CD8＋为T杀伤－抑制亚群，而CD4＋为T辅助－诱导亚群，当其数量和功能发生异常时，机体会发生免疫紊乱从而导致发病。有学者研究发现复发性口腔溃疡患者外周血中的CD4＋／CD8＋下降，CD4＋细胞数量下降，而CD8＋细胞数量正常，因此细胞免疫功能低下是复发性口腔溃疡发病和发展的关键因素之一［6］。本文结果显示，与对照组相比，模型组的大鼠外周血中的CD4＋细胞比例明显降低，而左旋咪唑组的大鼠外周血中的CD4＋细胞比例高于模型组，对比差异有统计学意义（P＜0．05）；3组的大鼠外周血中的CD8＋细胞比例对比无统计学差异（P＞0．05）。该结果与之前研究的结果基本一致，说明本实验中的动物模型可作为免疫失衡的动物模型。

研究证实，氧自由基可能是连接复发性口腔溃疡各种致病因素的共同枢纽环节，氧自由基在体内的聚集可降解为MDA，可对细胞中核酸、蛋白质及透明质酸等产生广泛的损伤作用。不过人体内存在着一套完备的抗氧化防御系统，其中每种抗氧化剂的活性高低都可以间接评价氧自由基的活动。现代药理研究表明左旋咪唑具有增强机体免疫力的作用，其可以增强机体的非特异性及特异性免疫功能［7］。且左旋咪唑抗氧化作用很强，可显著提高小鼠的非特异性免疫能力，且存在一定剂量效应。对混合淋巴细胞中的T细胞有增强作用，并能促进大鼠脾细胞分泌相关白介素细胞因子［8］。本文结果显示，与对照组相比，模型组的大鼠血清中MDA含量升高，SOD活性降低，对比差异具有统计学意义（P＜0．05）。而左旋咪唑组与模型组相比，大鼠血清中SOD活性升高，MDA含量降低，对比差异有统计学意义（P＜0．05）。

总之，T淋巴细胞亚群的失衡和血清相关因子在复发性口腔溃疡的发生发展中起到重要的作用，左旋咪唑可以有效的治疗大鼠复发性口腔溃疡，具体机制在于调节免疫功能与细胞因子的变化。

［1］ 房 栋，赵东盈．蒙脱石散与琥珀酸氢化可的松联合保留灌肠治疗溃疡性结肠炎60例［J］．陕西医学杂志，2013，42（11）：1558－1559．

［2］ 陈永梅，周作华，赵 颖，等．脂氧素受体激动剂BML－111对左向右分流大鼠肺动脉压力影响及其机制的研究［J］．陕西医学杂志，2013，42（5）：518－520．

［3］ 郎江蓉，武云霞．复发性阿弗他溃疡患者唾液及血清中TNF－α的表达及其相关性研究［J］．实用口腔医学杂志，2010，26（3）：353－355．

［4］ 孙勤国，江 波，崔晓燕，等．口疡清方对复发性口腔溃疡模型大鼠免疫功能的研究［J］．中西医结合研究，2013，5（2）：66－68．

［5］ 庞世权，陈 茵，余海清，等．长春瑞滨加醛氢叶酸和大剂量氟尿嘧啶治疗晚期三阴性乳腺癌［J］．中国现代医生，2013，51（34）：75－76．

［6］ 程 茜，刘建国，郭玉书，等．实验性SD大鼠ROU模型的建立［J］．临床口腔医学杂志，2008，24（9）：563－565．

［7］ 石展鹏．复发性口腔溃疡的中医治疗与研究进展［J］．陕西中医，2011，32（2）：247－250．

［8］ 祁 晶，余占海，刘 燕，等．免疫法建立SD大鼠RAU模型［J］．口腔医学研究，2010，26（6）：816－819．