多肋藻渣中褐藻胶提取工艺及其分离纯化研究

李丽迪，王 迪，汪秋宽，侯 丽，何云海，宋悦凡，丛海花

(大连海洋大学国家海藻加工技术研发分中心，辽宁大连116023)

多肋藻(Costaria costata)属于褐藻门、褐子纲、海带目、海带科、多肋藻属，在亚洲主要分布于日本及朝鲜半岛海域，是我国近年新栽培的褐藻［1］。多肋藻富含褐藻胶及多种人体必需的微量元素［2］，可食用，同时也是海藻工业的重要原料［3］。因多肋藻富含褐藻多糖硫酸酯，近些年对其的研究很多［4-5］，研究工作主要集中在多肋藻褐藻多糖硫酸酯与褐藻胶。多肋藻加工过程中会产生一些废弃藻渣，含有数量可观的褐藻胶，未见对多肋藻渣中有效成分的提取及分析相关研究与报道。因此本研究拟通过实验研究多肋藻渣中褐藻胶的最佳提取工艺，以期为多肋藻的高效综合利用奠定基础，为实际的加工生产节约成本［6］。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

多肋藻渣 多肋藻提取褐藻多糖硫酸酯［7］后剩余的物质，冷冻保存备用;褐藻胶标准品 食品级，青岛明月海藻集团有限公司提供;浓硫酸 国产优级纯;95%乙醇 食用乙醇;其他试剂均 国产分析纯。

Sartorius普及型pH计(PB-10) 赛多利斯科学仪器(北京)有限公司;HH-4型数显恒温水浴锅 常州国华电器有限公司;LD5-2A型离心机 北京医用离心机厂;ALPHAI-5型真空冷冻干燥机 德国制造;BS2000S型分析天平 北京赛多利斯仪器系统有限公司;722S型分光光度计 上海分析仪器总厂;SBS-160型数控计滴自动部分收集器 上海沪西分析仪器厂;CL-1A型磁力搅拌器 巩义市予华仪器有限责任公司;SZ-93型自动双重纯水蒸馏器 上海亚荣生化仪器厂;BT100-2J型恒流泵 保定兰格恒流泵有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 提取工艺流程 称取一定量多肋藻渣，加入一定浓度的碳酸钠溶液浸泡，恒温水浴加热一定时间，离心(4500r/min，15min)取上清液，加入95%(体积分数，下同)的食用乙醇，至溶液中乙醇含量为30%，离心，将得到的沉淀进行冷冻干燥，得到的粉末即为褐藻胶［8-9］。

1.2.2 单因素实验方法 在单因素实验时，以褐藻胶粗得率为检测指标，分析各因素对褐藻胶粗得率的影响。考察温度对褐藻胶粗得率的影响时，控制体系的碳酸钠浓度1%、料液比1∶25(g/mL)、提取时间5h，设置不同的提取温度(50、60、70、80、90℃)。考察时间对褐藻胶粗得率的影响时，控制体系的提取温度70℃，碳酸钠浓度1%，料液比1∶25(g/mL)，设置不同的提取时间(2、3、4、5、6h)。考察料液比对褐藻胶粗得率的影响时，控制体系的提取温度70℃，碳酸钠浓度1%，提取时间5h，设置不同的料液比(1∶15、1∶20、1∶25、1∶30、1∶35、1∶40、1∶45)。考察料液比对褐藻胶粗得率的影响时，控制体系的提取温度70℃，料液比 1∶40(g/mL)，提取时间 5h，设置不同的碳酸钠浓度(1.0%、1.5%、2.0%、2.5%、3.0%、3.5%、4.0%)。

1.2.3 正交实验方法 在单因素实验的基础上，以多肋藻渣中褐藻胶的粗得率和纯度为指标，采用4因素3水平正交设计探讨多肋藻渣中褐藻胶的最佳提取工艺，正交因素水平表见表1。

表1 正交实验因素水平表Table 1 The factors and levels of orthogonal experiments

1.2.4 得率和纯度的计算 粗得率(%)=粗褐藻胶质量/多肋藻渣质量×100

纯度(%)=咔唑硫酸法测定出的褐藻胶质量(g)/粗褐藻胶质量(g)×100

得率=粗得率×纯度

提取物中褐藻胶含量的测定采用咔唑硫酸法［10］。冰水浴中向9mL 80%浓硫酸中加入0.4mL 0.1%的褐藻胶溶液，加水补至10mL，沸水浴30min后冷却5min，加入0.3mL咔唑溶液，继续沸水浴10min，冷却后在530nm处测定吸光值;依褐藻胶标准曲线的回归方程y=1.650x(R2=0.999)计算褐藻胶含量。

1.2.5 分离纯化方法

1.2.5.1 D301-T弱碱性阴离子树脂交换层析 采用D301-T弱碱性阴离子树脂交换层析柱(φ2.6×30cm)纯化。称取一定量的褐藻胶溶解，先用0.2mol/L pH7.4的磷酸盐缓冲液洗脱，再经0～2mol/L NaCl线性梯度洗脱，流速1mL/min，自动部分收集器进行收集，每管4mL，咔唑硫酸法跟踪测定其褐藻胶含量，直到收集管中检测不出褐藻胶为止。

1.2.5.2 Sephacryl S-300凝胶层析 色谱柱φ1.6×90cm、缓冲液为0.2mol/L pH7.5磷酸盐缓冲液、速度为3mL/10min，每管3mL，标准品为蓝色葡聚糖(Blue dextran，type 2000)，葡聚糖(Mr=4.41 × 104Da，6.67×104Da，1.35 ×105Da，Sigma)将 D301-T 纯化褐藻胶得到的组分上柱，经过Sephacryl S-300凝胶层析，确定每个组分的相对分子质量范围。

1.2.6 理化性质 色泽及性状、pH、透光率和粘度测定采用GB 1976-2008，食品添加剂 褐藻酸钠［11］中的测定方法;重金属含量测定均采用国标中［12-13］的测定方法。

测定结果与GB 1976-2008，食品添加剂褐藻酸钠相比较。

2 结果与分析

2.1 单因素实验结果与分析

2.1.1 不同提取温度对褐藻胶粗得率的影响 提取温度对褐藻胶粗得率的影响见图1。随着温度的上升，褐藻胶的粗得率先增大后减小，当温度达到70℃，褐藻胶粗得率达到最高，为15.88%。考虑到温度过高时，可能导致大分子断裂成小分子，影响得率［14-15］。因此选取 65、70、75℃作正交优化以确定最佳提取温度。

图1 提取温度对褐藻胶粗得率的影响Fig.1 Influence of extracting temperature on the yield of sodium alginate

2.1.2 不同提取时间对褐藻胶粗得率的影响 提取时间对褐藻胶粗得率的影响见图2。随着时间的增加，褐藻胶的粗得率随时间的增加而增加，5h以后，褐藻胶的粗得率有所下降。这可能是因为提取时间短，藻体不能完全破坏，反应不完全;而当提取时间超过5h，褐藻胶又有所降解，从而导致其得率偏低［16］。因此选取 4.5、5.0、5.5h 作正交优化以确定最佳提取时间。

2.1.3 不同料液比对褐藻胶粗得率的影响 料液比对褐藻胶粗得率的影响见图3。随着料液比的增大，褐藻胶的粗得率呈上升趋势，并趋于平缓。当料液比为1∶40时，达到最佳的褐藻胶粗得率20.31%。适当的料液比能使原料中的褐藻胶得到充分提取，而且可减少溶剂的浪费，节省提取成本。因此选取1∶35、1∶40、1∶45 作正交优化以确定最佳料液比。

图2 提取时间对褐藻胶粗得率的影响Fig.2 Influence of extracting time on the yield of sodium alginate

图3 料液比对褐藻胶粗得率的影响Fig.3 Influence of Solid-Liquid Ratio on the yield of sodium alginate

2.1.4 不同碳酸钠浓度对褐藻胶粗得率的影响 碳酸钠浓度对褐藻胶粗得率的影响见图4。随着碳酸钠浓度的升高，褐藻胶的粗得率呈上升趋势，而后趋于平缓。当碳酸钠浓度为3.5%时，粗得率最高。碳酸钠浓度低时得率低，可能是因为藻体不能完全破坏，反应不完全;而且碳酸钠溶液的浓度过高，会造成生产成本的提高，降低经济效益。因此选取3.0%、3.5%、4.0%作正交优化以确定最佳碳酸钠浓度。

图4 碳酸钠浓度对褐藻胶粗得率的影响Fig.4 Influence of Na2CO3 concentration on the yield of sodium alginate

2.2 正交提取条件的优化

在单因素实验的基础上，以褐藻胶粗提率和纯度为指标进行L9(34)正交实验，实验结果见表2，验证实验见表3。

由表2中可以看出，以粗得率为指标的因素影响程度依次为:C、A、D、B，理论最佳组合为A2B3C3D2，而实验最佳组合为A3B1C3D2;以纯度为指标的因素影响程度依次为:C、B、D、A，理论最佳组合为A2B3C2D2，而实验最佳组合为A1B2C2D2。

表2 褐藻胶提取工艺正交实验结果Table 2 Orthogonal test results of extraction technology of alginate from Costaria costata residues

表3 褐藻胶提取最佳条件验证实验Table 3 The comparison analysis of the extraction of sodium alginate at the optimum conditions

为确定碱提法提取褐藻胶的最佳工艺参数，对组合A2B3C3D2和A2B3C2D2进件验证。粗得率最高组为A3B1C3D2，但其纯度最低;A1B2C2D2的纯度和得率均最高，其粗得率最低。在综合考虑下，选取A1B2C2D2作为实验的最佳组合。因此，确定了碱提法提取褐藻胶的最佳工艺参数:提取时间4.5h、料液比1∶40、碱液浓度3.5%、提取温度70℃，在该条件下水解，多肋藻渣中褐藻胶的粗得率为44.07% ±0.22%，纯度为94.77% ±0.19%。在最佳提取工艺条件下进行中试生产供后期实验使用。

2.3 分离纯化研究

2.3.1 D301-T弱碱性阴离子树脂柱层析 D301-T弱碱性阴离子树脂柱层析洗脱曲线见图5。由图5可见，梯度洗脱后共有2个峰，分别称为F1、F2，其中F1为未经盐洗脱的流出峰，其回收率分别为19.33%和63.33%;褐藻胶含量分别为84.56%和89.69%。

图5 D301-T梯度洗脱曲线Fig.5 The grading elution curve of alginate on D301-T column

2.3.2 Sephacryl S-300凝胶层析 通过蓝葡聚糖标准品(Mr＞2.0×106)，以及葡聚糖标准品(Mr=4.41×104、6.67 ×104、1.35 ×105)，得到外水体积为87mL，相对分子质量标准曲线方程y=-2.5417x+5.5216，R2=0.9993。

将组分F1和F2分别经过Sephacryl S-300凝胶柱层析，进一步分离纯化，并测定其相对分子质量。洗脱曲线如图6、图7所示。

图6 F1的Sephacryl S-300凝胶柱层析图谱Fig.6 Chromatogram of F1 with Sephacryl S-300 column

图7 F2的Sephacryl S-300凝胶柱层析图谱Fig.7 Chromatogram of F2 with Sephacryl S-300 column

由图 6和图 7可以看出，组分 F1，F2经Sephacryl S-300凝胶柱层析分别只得到一个对称峰，这表明各组分组成均一、纯度较高。F1的洗脱峰其相对分子质量为257ku;F2的洗脱峰其相对分子质量为81ku。

2.4 理化性质

检测褐藻胶粗提物、组分F1和组分F2的理化性质，检验结果如表4。三者均溶于水，不溶于乙醇、甲醇等有机溶剂。根据GB 1976-2008，食品添加剂褐藻酸钠中规定，褐藻胶、组分F1和组分F2的色泽、性状、pH、透光率和重金属含量均符合标准，但粘度过低，可能是因为多肋藻在提取褐藻多糖硫酸酯的过程中经过98℃高温蒸煮导致褐藻胶的降解，这与盘茂东等［14］的研究结果相一致。

表4 理化性质Table 4 Physical and chemical properties

3 结论

褐藻胶是海带、海藻、巨藻等所有褐藻属中都含有的主要成分［17］。褐藻胶作为一种天然高分子物质以其良好的生物降解性和生物相容性，以及良好的增稠性、成膜性、稳定性、絮凝性和螯合性［18］而被广泛应用于化学、生物、医药、食品等领域［18-22］。

利用多肋藻提取褐藻多糖硫酸酯后，剩余大量藻渣，既造成资源的浪费，又会对环境有一定的破坏。本文采用正交实验方案研究了从多肋藻渣中提取褐藻胶的工艺研究，得出最佳的提取工艺条件是时间 4.5h、料液比 1∶40、Na2CO3浓度 3.5%、温度70℃，褐藻胶的粗得率为44.07%，纯度为94.77%。这说明用碱提法提取多肋藻渣中褐藻胶是可行的，而且得率和纯度均较高。

褐藻胶F经D301-T弱碱性阴离子树脂柱层析和Sephacryl S-300凝胶柱层析得到两个单一组分，相对分子质量分别为257、81ku，这与其粘度测定结果相符。重金属检测显示其含量均未超标。本文介绍的提取工艺流程简单易行，成本低，适合于工业生产，对充分高效利用多肋藻有重要的理论和实践意义。

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