抗虫基因cry1Ab/Ac 在水稻杂交转育后代中的表达效应

杨 宙，康美花，刘建华，裴冬莲，张标金，张晓宁，曹丰生*

(1.江西省农业科学院 水稻研究所/水稻国家工程实验室(南昌)，江西 南昌 330200;2.江西省农业科学院 农产品质量安全与标准研究所，江西 南昌 330200)

水稻是亚洲国家的主要粮食作物，对其造成危害的昆虫超过200 种，其中的5 种主要害虫分别是鳞翅目的螟虫和同翅目的飞虱［1］。鳞翅目的主要害虫是三化螟、二化螟和稻纵卷叶螟，每年都造成巨大的损失。在我国南方的双季稻种植区，晚稻一般在7 月份移栽，其分蘖期和抽穗期适逢这3 种螟虫发生的高峰，受到的危害更为严重。随着植物基因工程的发展，许多Bt 基因被导入水稻中，成功地获得了对这3 种螟虫具有抗性的转基因品系，并进行了一些田间试验和安全性评价。本研究中所转育的cry1Ab/Ac 是一个融合的Bt 基因，已经被证实能在水稻中高效地表达并发挥作用［2］。

原始的转基因水稻材料农艺性状会受到影响，难以直接应用于农业生产。因此，需要通过常规育种方法将抗虫基因导入栽培品种中进行改良，而抗虫基因在这一过程中的遗传和表达是实现育种目标的重要因素。诸多研究表明，转入水稻的外源基因能在杂交后代中稳定地遗传和表达，为抗虫基因的应用提供了广阔的前景［3-4］。外源基因转入植物后，其表达必然要消耗物质和能量，对植物其它性状的表现产生不利的影响。外源基因的表达产物还可能有多效性，影响植物的结构特点和代谢途径［5-6］。有研究表明，将Bt 基因转入棉花后，植株对钾离子的吸收和转运能力发生了改变［7］。目前还不能确定Bt 蛋白对水稻植株有负面影响，但Bt 水稻农艺性状的变异是普遍存在的，这些变异与Bt 基因表达水平之间的关系还有待阐明。

本研究以转cry1Ab/Ac 的籼稻品系TT51 为供体，与多个恢复系杂交。通过分子检测和抗虫性观察，检验抗虫基因在杂交后代中的遗传规律。然后测定不同遗传背景下的Bt 基因表达水平，分析其对抗虫性和农艺性状的影响，旨在为利用杂交转育培育优质高产的抗虫水稻提供依据。

1 材料与方法

1.1 亲本材料

杂交的父本转基因品系TT51 由华中农业大学提供，是通过基因枪法将Bt 融合基因cry1Ab/Ac 导入籼稻恢复系明恢63 后得到的。母本材料有10 个，分别是广恢998、先恢207、R163、R288、R451、G11012、G11112、G11553、G11796 和G11995。其中前5 个是目前国内育成并广泛应用的恢复系，其余5个是本课题组育成的恢复系材料。

1.2 杂交与选择

在水稻的抽穗开花期将母本植株上未授粉的颖花人工去雄，然后取父本的花粉授粉，套袋至成熟后收获。PCR 分子检测取水稻叶片，用CTAB 法抽提总DNA 作为模板，用针对cry1Ab/Ac 基因的特异引物扩增。扩增引物为Cry1A-F 和Cry1A-R，引物序列以及反应体系和程序参考相关的文献［8］。扩增片段为494 bp，通过8 g/L 的琼脂糖凝胶电泳分离，染色后在紫外光下观察。

利用PCR 检测在F1代去除假杂种，在F2代检验外源基因的分离比，每个F2代群体检测40 个单株。选择转基因阳性的F2代单株收种，并自交加代。在F3代考察单株的抗虫性，选择农艺性状良好的抗性单株收种。在F4代筛选出10 种杂交组合的转基因纯合株系和对应的阴性株系，用于Cry1Ab/Ac 蛋白含量的测定和后续的田间试验。

1.3 Cry1Ab/Ac 蛋白含量测定

水稻中Cry1Ab/Ac 蛋白含量用上海佑隆生物科技有限公司的Cry1Ab/Ac 酶联免疫定量检测(ELISA)试剂盒测定。每个株系选4 个单株，在分蘖期取叶片，拔节期取茎秆。称取约10 mg 样品，用0.5 mL 的抽提液研磨成匀浆，静置30 min 后吸取上清液，稀释一定的倍数用于测定。ELISA 测定的操作过程参考说明书，反应结束后用法国生物梅里埃公司的SH1000 型酶标仪读取450 nm 波长下的吸光度值。绘制标准曲线，在上面读出待测样品的蛋白浓度，计算水稻组织的蛋白含量。不同株系的Cry1Ab/Ac 蛋白含量用成组数据的t 测验进行比较。

1.4 田间抗性评价

2013 年，笔者在位于南昌县广福镇的转基因试验基地对转基因水稻的抗虫性进行了评价。参试的水稻材料有12 个，分别是敏感对照明恢63、抗性对照TT51 以及10 个杂交组合的纯合株系。水稻材料于5 月下旬播种，6 月下旬移栽。田间试验按照随机区组设计，3 个重复，每个小区种植两行共20 单株。采用常规的水肥管理，不防治螟虫，做自然发虫处理。在水稻的分蘖盛期调查卷叶数，拔节期调查分蘖数和枯心数，计算枯心率。调查数据用SPSS12.0 软件统计分析，通过LSD 法的t 测验来检验各转育株系与亲本TT51 之间抗性差异的显著性。

1.5 田间农艺性状考察

2013 年，笔者在转基因试验基地的其它田块中对各水稻株系的农艺性状进行了考察。参试的水稻材料有20 个，分别是10 个杂交组合的纯合株系及对应的阴性株系。田间试验的设计与前面相同，不同的是每个小区的两行中1 行为纯合株系，另1 行为其对应的阴性株系。采用常规的水肥管理，喷洒杀虫剂，防治螟虫危害。成熟后测量水稻的株高，然后收获考察穗长、每穗粒数、结实率、千粒质量和单株产量。用成对数据的t 测验来检验各纯合株系相对其阴性株系农艺性状差异的显著性。

2 结果与分析

2.1 杂交转育后代的检测和筛选

在PCR 分子检测中，F2代单株出现转基因阳性和阴性两种表型(图1)。统计了10 个F2代群体中的阳性和阴性植株的数目，并对这两种植株的总数进行了分析，经X2检验都符合3∶1 的比例，说明cry1Ab/Ac 基因在杂交转育后代中是按照孟德尔规律遗传的(表1)。

图1 F2代植株的PCR 检测Fig.1 PCR analysis of the F2plants

表1 cry1Ab/Ac 基因在F2代群体中的分离Tab.1 Segregation of cry1Ab/Ac gene in the F2populations

2.2 纯合株系中的Cry1Ab/Ac 蛋白含量

Cry1Ab/Ac 蛋白在亲本TT51 叶片中的浓度为17.0 μg/g 鲜质量，在各转育株系中为9.7～17.2 μg/g 鲜质量，有6 个株系显著降低。Cry1Ab/Ac 蛋白在TT51 茎秆中的浓度为3.02 μg/g 鲜质量，在各转育株系中为1.30～3.12 μg/g 鲜质量，有4 个株系显著降低(表2)。叶片与茎秆之间蛋白含量的相关系数为0.775，计算结果表明二者呈极显著正相关。

表2 叶片和茎秆中的Cry1Ab/Ac 蛋白含量Tab.2 Concentration of Cry1Ab/Ac protein in leaf and stem

2.3 纯合株系在田间的抗虫性

在田间自然发虫的条件下，敏感对照明恢63 单株卷叶数为5.43，枯心率为19.37%，受螟虫危害较严重。抗性对照TT51 单株卷叶数仅为0.57，枯心率为2.27%，基本没有受到虫害的影响。7 个纯合株系的抗虫性表现与TT51 一样，另外3 个株系的单株卷叶数和枯心率比TT51 极显著地增加(表3)。但是与明恢63 相比，它们受害的程度仍然很轻微。

表3 纯合株系所受的螟虫危害Tab.3 Damage symptoms caused by pests on homozygous lines

2.4 纯合株系的农艺性状

在防治螟虫的处理下，所有的株系都没有出现卷叶和枯心。经过了3 代筛选，各株系的群体表现趋于一致和稳定，农艺性状相对于亲本TT51 都得到了一定程度的改良。其中G11012/TT51、G11553/TT51 和G11995/TT51 这3 个株系的结实率接近90%，R288/TT51、R451/TT51 和G11796/TT51 的单株产量接近或超过30 g，株叶形态优良，展现出了较好的应用潜力(表4)。

与对应的阴性株系相比，大部分转基因纯合株系的农艺性状较差，株高变矮，产量降低。变异较为普遍的性状是株高、千粒质量和单株产量，穗粒数和结实率的变异只发生在少数株系中。结合cry1Ab/Ac 基因的表达水平分析发现，蛋白含量较高的7 个株系中有6 个植株变矮，千粒质量降低，5 个株系的单株产量显著低于对应的阴性株系。G11553/TT51、G11796/TT51 和G11995/TT51 这3 个蛋白含量较低的株系农学性状变异较少(表4)。这些结果表明cry1Ab/Ac 基因的表达对水稻的株高、千粒质量和单株产量有较大的影响。

表4 纯合株系的农艺性状及其变异Tab.4 Agronomic traits and variations of homozygous lines

3 讨论与结论

转基因过程中，外源基因通过异常重组整合到水稻的基因组上，在部分家系中可能不按照孟德尔规律分离，甚至会随着世代的增加而丢失［9］。TT51 是经过筛选，被证明外源基因按照孟德尔规律遗传的转基因家系。10 个F2代群体中的阳性和阴性植株以及这两种植株的总数按照3∶1 分离，说明cry1Ab/Ac 基因也能在这些杂交转育后代中稳定地遗传，与其它类似研究的结论是一致的［10-11］。

Bt 基因在植物中的表达水平与多种因素有关，如载体的表达元件，转基因插入位点，植物的遗传背景、组织器官和发育阶段等［12］。本研究中各株系叶片和茎秆中cry1Ab/Ac 基因表达水平差异很大，前者的蛋白含量是后者的5 倍左右，这主要是由叶片和茎秆不同的组织结构和生理功能引起的。取样是在水稻的营养生长期，叶片作为主要的光合作用器官，蛋白质合成旺盛并迅速积累。而茎秆主要由输导组织和机械组织构成，负责物质的运输和支撑水稻结构，Bt 蛋白难以在其中形成较高的浓度。株系之间cry1Ab/Ac 基因表达水平差异也较大，多个转育后代的叶片和茎秆Bt 蛋白含量与亲本TT51 相比显著降低，最多的相差2 倍以上。各株系的Bt 基因表达元件和插入位点，以及取样的组织和时期都相同，因此表达水平的差异应该归结于遗传背景的不同。Bt 基因表达水平除受植物物种影响外，在相同物种的不同品种间也会存在差异［13］。这里Cry1Ab/Ac 蛋白含量极显著降低的株系是G11553/TT51、G11796/TT51 和G11995/TT51，其中的母本G11553 带有部分粳稻血缘，G11796 和G11995 带有部分野生稻血缘。因此，笔者推测双亲之间遗传背景差异较大会抑制Bt 基因在杂交后代中的表达。

cry1Ab/Ac 基因编码的是Cry1A 类的蛋白，对鳞翅目昆虫的毒性很强，已经在多种商业化种植的作物中发挥作用。部分株系的Cry1Ab/Ac 蛋白含量显著降低，叶片中最低为8.3 μg/g，茎秆中最低为1.3 μg/g。但是出现的枯心和卷叶很少，产量的损失几乎可以忽略。这说明较低的Cry1Ab/Ac 浓度仍然能够有效地防治螟虫，对转基因家系的选择可以在更宽的Bt 蛋白浓度范围内进行。

转基因纯合株系和阴性株系的遗传背景基本相同，主要的差别在于转基因插入位点上。cry1Ab/Ac基因的插入并没有引起水稻内源功能基因的失活，而转化过程产生的体细胞变异在阳性和阴性株系中共同存在，所以二者农艺性状之间的差异主要归因于cry1Ab/Ac 基因的表达。结合表2 和表4 进行分析，发现蛋白含量较高的株系株高和千粒质量的变异较大，并最终影响了产量。因此，在满足抗性所需Bt 蛋白浓度的前提下，可以注重对农艺性状的考察，选择蛋白浓度适量且性状优良的转基因株系作为育种的亲本。本研究中转育得到的部分株系抗虫性良好，农艺性状变异小，在水稻育种中具有广泛应用的潜力。

［1］Chen M，Shelton A，Ye G Y.Insect-resistant GM rice:ten years of field testing in China［J］.Annual Review Entomology，2011(56):81-101.

［2］Tu J M，Zhang G A，Datta K，et al.Field performance of transgenic elite commercial hybrid rice expressing Bacillus thuringiensis δ-endotoxin［J］.Nature Biotechnology，2000，18(10):1101-1104.

［3］Peng J Y，Kononowicz H，Hodges T K.Transgenic indica rice plants［J］.Theoretical and Applied Genetics，1992，83(6/7):855-863.

［4］Chen H，Tang W，Xu C G，et al.Transgenic indica rice plants harboring a synthetic cry2A*gene of Bacillus thuringiensis exhibit enhanced resistance against lepidopteran rice pests［J］.Theoretical and Applied Genetics，2005，111(7):1330-1337.

［5］Bergelson J，Purrington C B，Palm C J，et al.Costs of resistance:a test using transgenic Arabidopsis thaliana［J］.Proceedings of Biological Sciences，1996，263(1377):1659-1663.

［6］Saxena D，Stotzky G.Bt corn has a higher lignin content than non-Bt corn［J］.American Journal of Botany，2001，88(9):1704-1706.

［7］Zhang M，Wang X C，Yan W D，et al.K+and Na+uptake and transport and SOD activity in Bt transgenic cotton seedlings under salt stress［J］.Acta Pedologica Sinica，2005，42(3):460-467.

［8］Yang Z，Chen H，Tang W，et al.Development and characterisation of transgenic rice expressing two Bacillus thuringiensis genes［J］.Pest Management Science，2011，67(4):414-422.

［9］华志华，黄大年.转基因植物中外源基因的遗传学行为［J］.植物学报，1999，41(1):1-5.

［10］崔海瑞，王忠华，舒庆尧，等.转Bt 基因水稻克螟稻杂交转育后代农艺性状的研究［J］.中国水稻科学，2001，15(2):101-106.

［11］柳絮，王文英，李军，等.利用回交转育培育黄淮稻区抗虫转基因水稻新品系［J］.山东农业科学，2013，45(1):38-41.

［12］卢美贞，崔海瑞，姚艳玲，等.影响苏云金芽孢杆菌基因在转基因植物中表达的因素［J］.细胞生物学杂志，2005，27(5):509-513.

［13］耿军义，张香云，王兆晓，等.Bt 基因在不同陆地棉基因型的表达研究［J］.棉花学报，2003，15(1):8-12.