高效液相色谱法对水产品中虾青素的测定

吴祥庆+黎小正+杨姝丽+吴明媛+谢宗升+陈静+秦振发+黄鸾玉

摘要：建立水产品中虾青素含量的高效液相色谱测定方法。样品经乙腈萃取、超声提取、离心后，将上清液旋转蒸发、定容，用液相色谱-紫外检测器检测，外标法定量。虾青素浓度在0.02～10.00 μg/mL范围内线性关系好，相关系数0.999 5;加标回收率为91.9%～95.8%，检出限为10.00 μg/kg。该方法准确度高，重现性好，易操作，适用于水产品中虾青素含量的测定。

关键词：高效液相色谱法;虾青素;水产品

中图分类号：O657.6            文献标识码：A          文章编号：0439-8114（2014）20-4958-02

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2014.20.050

Determing Astaxanthin in Aquatic Products with HPLC

WU Xiang-qing，LI Xiao-zheng，YANG Shu-li，WU Ming-yuan，Xie Zong-sheng，Chen Jing，

QIN Zhen-fa，HUANG Luan-yu

（Fisheries Disease Prevention Environmental Monitoring and Quality Testing Center of Guangxi， Guangxi Academy of Fishery

Sciences， Nanning 530021， China）

Abstract： A HPLC method was developed to analyzed of astaxanthin in aquatic products. The samples were ultrasonically extracted with acetonitrile after centrifugation. The supernatant was evaporated and resolved. The determination was performed by HPLC with UV detector. The external calibration standard was used for quantification. The linear range was 0.02～10 μg/mL（R=0.999 5）with a good linearity. The recovery range was in 91.9%～95.8% with the detection limit of 10 μg/kg. The method is accurate， reproducible， easy for determing astaxanthin in aquatic products.

Key words： HPLC; astaxanthin; aquatic products

虾青素（Astaxanthin）化学名称为3，3′-二羟基-4，4′-二酮基-β，β′-胡萝卜素，分子式为C40H52O4，广泛存在于生物中，其抗氧化活性是维生素E的500倍以上[1，2]，具有抗肿瘤、降血脂以及增强人体免疫的功能[3，4]。虾青素为海洋甲壳类动物和鱼类色素的主要成分，鲑鱼、龙虾等海产品红润的肉色即为虾青素所体现，但人工养殖的水产品无法合成虾青素，须在饲料中补给[5]。因此，目前虾青素主要作为水产养殖的添加剂，广泛应用于黄颡鱼、胡子鲶、大口鲶和甲鱼等，是我国农业部在1126公告（2008）中惟一允许使用的着色剂。虾青素主要来源于人工合成和天然动物提取，饲料中使用的虾青素主要为人工合成品，合成虾青素在组织中沉积率要高于天然色素[6]，且价格便宜。虾青素的检测方法包括薄层色谱法、分光光度法[7，8]、色谱法[9，10]。本试验建立高效液相色谱法测定水产品中虾青素，方法操作简单、结果准确，适用于水产品中虾青素定量测定。

1  材料与方法

1.1  仪器

Accela液相色谱仪（美国Thermo公司），配PDA检测器;B-490旋转蒸发仪（美国BUCHI公司）;TDD-4离心机（长沙平凡仪器仪表有限公司）;SK3300LH超声仪（上海科导仪器公司）。

1.2  试剂

标准物质虾青素，纯度≥98%，购于德国Dr. Ehrenstorfer公司。乙腈为色谱纯，购自国药集团化学试剂有限公司。

1.3  方法

1.3.1  虾青素标准溶液的配制  称取虾青素10 mg，用乙腈定容至100 mL，配成浓度为100 μg/mL的标准储备液，4℃避光保存。以乙腈为稀释液，配制0～1 μg/mL系列浓度标准工作液，临用前配制。

1.3.2  样品前处理  称取5 g均质样品于50 mL离心管中，加入10 mL乙腈，超声提取2 min，匀浆提取30 s，4 000 r/min离心5 min。另取50 mL离心管加10 mL乙腈，洗涤匀浆刀头10 s，合并洗涤液，漩涡30 s，超声提取2 min，4 000 r/min离心5 min;合并上清液，旋转蒸发至干，用乙腈定容至10 mL，过0.22 μm滤膜，待上机分析。

1.3.3  色谱分析  色谱柱Hypersil GOLD C18色谱柱（2.1 mm×100 mm，1.9 μm），0.2 mL/min，柱温30 ℃，进样量20 μL，检测波长475 nm;流动相A为乙腈，B为去离子水。梯度洗脱程序见表1。在相同条件下，做空白试验，采用外标法定量。

1.3.4  回收率分析   称取空白水产品5 g，分别添加3个水平的虾青素标准溶液（10、50和100 μg/kg）按1.3.2和1.3.3分析，每个浓度水平重复6次。

2  结果与分析

2.1  标准溶液色谱图

在上述色谱条件下，2.00 μg/mL虾青素标准溶液的色谱图如图1所示。

将标准工作溶液进行色谱分析。以峰面积为纵坐标，以虾青素浓度为横坐标，绘制标准曲线，其线性方程为Y=4 605.3X-59 898，R=0.999 5，在0.02～10 μg/mL呈良好线性关系。

2.2  样品测定

将样品溶液按上述方法分析，记录色谱峰面积，根据标准曲线计算样品中虾青素含量，采用外标法定量。

2.3  方法的准确度和精密度

加标回收和精密度试验结果见表2。由表2可知，虾青素回收率为91.9%～95.8%，RSD为1.9%～4.7%。结果表明，加标回收率为70.0%～120.0%，RSD<20%，准确度和精密度符合技术要求，可用于水产品中虾青素含量测定。

2.4  方法检出限

以空白水产品为基质加标，按照3倍信噪比估算最低检出限，本方法检测限为10 μg/kg。

3  小结

本试验采用乙腈萃取、超声提取、离心等步骤处理水产品，获得样品提取液，以乙腈和水为流动相，实现水产品中虾青素的定量分析，该方法操作简单，消耗少，灵敏度、精密度高，回收率好，可满足水产品中虾青素含量定量检测要求。

参考文献：

[1] KRUASHIGE M， OKIMASU M， UTSUMI K. Inhibition of oxidative injury of biological membranes by astaxanthin[J]. Physiol Chem Phys Med，1990，22（1）：27-38.

[2] 裴凌鹏，惠伯棣，董福慧.虾青素改善D-半乳糖致衰大鼠抗氧化功能的研究[J].国外医学（老年医学分册），2006，27（6）：283-286.

[3] ANDERSON M L. A preliminary investigation of the enzymatic inhibition of 5 alpha-reductase and growth of prostatic carcinoma cell line LNCap-FGC by natural astaxanthin and saw palmetto lipid extract invitro[J]. Journal of Herbal Pharmacotherapy，2005，5（1）：17-26.

[4] 彭光华，李  忠，张声华，等.6种类胡萝素对人乳腺癌细胞株细胞间隙连接通讯功能影响的比较[J].食品科学，2008，29（6）： 45-48.

[5] 於亚兵，杨志刚.虾青素在水产养殖中的应用[J].中国水产， 2007（6）：65-66.

[6] 孟现成，雷  剑.虾青素在鱼类饵料中的应用研究进展[J].河北渔业，2008，179（11）：1-9.

[7] TOLASA S， CAKLI S， OSTERMEYER U. Determination of astaxanthin and canthaxanthin in salmonid[J]. European Food Research and Technology，2005，221（6）：787-791.

[8] 许培雅，郑裕国，沈寅初.分光光度法测定红发夫酵母中虾青素含量[J].浙江工业大学学报，2001，29（2）：120-135.

[9] 姜  淼，杨贤庆，李来好，等.高效液相色谱法测定虾壳中的虾青素[J].食品科学，2010，31（20）：371-375.

[10] 陈晋明，王世平，陈  敏.反相高效液相色谱法检测虾青素[J].化学分析计量，2006，15（2）：27-29.

1.3.4  回收率分析   称取空白水产品5 g，分别添加3个水平的虾青素标准溶液（10、50和100 μg/kg）按1.3.2和1.3.3分析，每个浓度水平重复6次。

2  结果与分析

2.1  标准溶液色谱图

在上述色谱条件下，2.00 μg/mL虾青素标准溶液的色谱图如图1所示。

将标准工作溶液进行色谱分析。以峰面积为纵坐标，以虾青素浓度为横坐标，绘制标准曲线，其线性方程为Y=4 605.3X-59 898，R=0.999 5，在0.02～10 μg/mL呈良好线性关系。

2.2  样品测定

将样品溶液按上述方法分析，记录色谱峰面积，根据标准曲线计算样品中虾青素含量，采用外标法定量。

2.3  方法的准确度和精密度

加标回收和精密度试验结果见表2。由表2可知，虾青素回收率为91.9%～95.8%，RSD为1.9%～4.7%。结果表明，加标回收率为70.0%～120.0%，RSD<20%，准确度和精密度符合技术要求，可用于水产品中虾青素含量测定。

2.4  方法检出限

以空白水产品为基质加标，按照3倍信噪比估算最低检出限，本方法检测限为10 μg/kg。

3  小结

本试验采用乙腈萃取、超声提取、离心等步骤处理水产品，获得样品提取液，以乙腈和水为流动相，实现水产品中虾青素的定量分析，该方法操作简单，消耗少，灵敏度、精密度高，回收率好，可满足水产品中虾青素含量定量检测要求。

参考文献：

[1] KRUASHIGE M， OKIMASU M， UTSUMI K. Inhibition of oxidative injury of biological membranes by astaxanthin[J]. Physiol Chem Phys Med，1990，22（1）：27-38.

[2] 裴凌鹏，惠伯棣，董福慧.虾青素改善D-半乳糖致衰大鼠抗氧化功能的研究[J].国外医学（老年医学分册），2006，27（6）：283-286.

[3] ANDERSON M L. A preliminary investigation of the enzymatic inhibition of 5 alpha-reductase and growth of prostatic carcinoma cell line LNCap-FGC by natural astaxanthin and saw palmetto lipid extract invitro[J]. Journal of Herbal Pharmacotherapy，2005，5（1）：17-26.

[4] 彭光华，李  忠，张声华，等.6种类胡萝素对人乳腺癌细胞株细胞间隙连接通讯功能影响的比较[J].食品科学，2008，29（6）： 45-48.

[5] 於亚兵，杨志刚.虾青素在水产养殖中的应用[J].中国水产， 2007（6）：65-66.

[6] 孟现成，雷  剑.虾青素在鱼类饵料中的应用研究进展[J].河北渔业，2008，179（11）：1-9.

[7] TOLASA S， CAKLI S， OSTERMEYER U. Determination of astaxanthin and canthaxanthin in salmonid[J]. European Food Research and Technology，2005，221（6）：787-791.

[8] 许培雅，郑裕国，沈寅初.分光光度法测定红发夫酵母中虾青素含量[J].浙江工业大学学报，2001，29（2）：120-135.

[9] 姜  淼，杨贤庆，李来好，等.高效液相色谱法测定虾壳中的虾青素[J].食品科学，2010，31（20）：371-375.

[10] 陈晋明，王世平，陈  敏.反相高效液相色谱法检测虾青素[J].化学分析计量，2006，15（2）：27-29.

1.3.4  回收率分析   称取空白水产品5 g，分别添加3个水平的虾青素标准溶液（10、50和100 μg/kg）按1.3.2和1.3.3分析，每个浓度水平重复6次。

2  结果与分析

2.1  标准溶液色谱图

在上述色谱条件下，2.00 μg/mL虾青素标准溶液的色谱图如图1所示。

将标准工作溶液进行色谱分析。以峰面积为纵坐标，以虾青素浓度为横坐标，绘制标准曲线，其线性方程为Y=4 605.3X-59 898，R=0.999 5，在0.02～10 μg/mL呈良好线性关系。

2.2  样品测定

将样品溶液按上述方法分析，记录色谱峰面积，根据标准曲线计算样品中虾青素含量，采用外标法定量。

2.3  方法的准确度和精密度

加标回收和精密度试验结果见表2。由表2可知，虾青素回收率为91.9%～95.8%，RSD为1.9%～4.7%。结果表明，加标回收率为70.0%～120.0%，RSD<20%，准确度和精密度符合技术要求，可用于水产品中虾青素含量测定。

2.4  方法检出限

以空白水产品为基质加标，按照3倍信噪比估算最低检出限，本方法检测限为10 μg/kg。

3  小结

本试验采用乙腈萃取、超声提取、离心等步骤处理水产品，获得样品提取液，以乙腈和水为流动相，实现水产品中虾青素的定量分析，该方法操作简单，消耗少，灵敏度、精密度高，回收率好，可满足水产品中虾青素含量定量检测要求。

参考文献：

[1] KRUASHIGE M， OKIMASU M， UTSUMI K. Inhibition of oxidative injury of biological membranes by astaxanthin[J]. Physiol Chem Phys Med，1990，22（1）：27-38.

[2] 裴凌鹏，惠伯棣，董福慧.虾青素改善D-半乳糖致衰大鼠抗氧化功能的研究[J].国外医学（老年医学分册），2006，27（6）：283-286.

[3] ANDERSON M L. A preliminary investigation of the enzymatic inhibition of 5 alpha-reductase and growth of prostatic carcinoma cell line LNCap-FGC by natural astaxanthin and saw palmetto lipid extract invitro[J]. Journal of Herbal Pharmacotherapy，2005，5（1）：17-26.

[4] 彭光华，李  忠，张声华，等.6种类胡萝素对人乳腺癌细胞株细胞间隙连接通讯功能影响的比较[J].食品科学，2008，29（6）： 45-48.

[5] 於亚兵，杨志刚.虾青素在水产养殖中的应用[J].中国水产， 2007（6）：65-66.

[6] 孟现成，雷  剑.虾青素在鱼类饵料中的应用研究进展[J].河北渔业，2008，179（11）：1-9.

[7] TOLASA S， CAKLI S， OSTERMEYER U. Determination of astaxanthin and canthaxanthin in salmonid[J]. European Food Research and Technology，2005，221（6）：787-791.

[8] 许培雅，郑裕国，沈寅初.分光光度法测定红发夫酵母中虾青素含量[J].浙江工业大学学报，2001，29（2）：120-135.

[9] 姜  淼，杨贤庆，李来好，等.高效液相色谱法测定虾壳中的虾青素[J].食品科学，2010，31（20）：371-375.

[10] 陈晋明，王世平，陈  敏.反相高效液相色谱法检测虾青素[J].化学分析计量，2006，15（2）：27-29.