猪圆环病毒病原学研究进展

王志军等

摘 要：猪圆环病毒（porcine circovirus，PCV）有2种不同的血清型，即猪圆环病毒1型（PCV1）和猪圆环病毒2型（PCV2）。目前研究表明PCV1暂无致病性，但PCV2则被认为是引起猪圆环疾病（PCVDs）的主要病原。很多地区养猪业的经济效益因此而遭受了重大的影响。PCV现已受到全球的关注，引起了许多专家学者的高度重视。本文对PCV的病原学最新研究进展进行了综述。

关键词：猪圆环病毒；PCV2；病原特性；基因结构

中图分类号：S852.65+9.2 文献标识码：A DOI 编码：10.3969/j.issn.1006-6500.2014.08.017

Abstract： Porcine circovirus virus （PCV） has 2 serotype， named porcine circovirus virus type 1 （PCV1） and porcine circovirus type 2 （PCV2）. PCV1， the first discovered one， has no pathogenity to pigs， while PCV2， the newly defined virus，is recognized as one of the main pathogens for PCVDs. The disease has prevalented in many countries and cause huge economic loss and also pose great challenges to the pig production industry. It is highly valued by scholars in Home and Abroad. This paper reviewed the development of the pathogeny of PCV2.

Key words： porcine circovirus； PCV2； pathogen characteristics； genetic structure

1 发现及分类地位

迄今，人们对猪圆环病毒的起源和进化过程了解得并不多。可追溯的最早的有关于PCV感染猪群的资料是在1962年的德国[1]。Hans Nauwynck 博士通过血清学方法研究证实，猪圆环病毒于20世纪70年代以前就已出现。1974年，Tischer I 等首次报道在PK-15细胞中发现猪圆环病毒（PCV1），由于该病毒不引起细胞发生病变，当时被认为仅仅是一种细胞污染物。通过深入研究，Tischer I 等[2]进一步证实这种细胞污染物实际上是一种单链的环状DNA病毒， 并将其命名为猪圆环病毒。加拿大在1991年报道了一种新猪病——断奶仔猪多系统衰竭综合征（Postweaning pigs multi-systemic wasting syndrome， PMWS）。该国的养猪业由于PMWS在猪群中的广泛流行而遭受了很大的损失。Harding 和Clark 等从PMWS 的病料中分离鉴定出的病毒与已发现的PCV有70%的同源性，从而认识到该病毒有不同的致病特性，故将无致病性的PCV命名为PCV1，有致病性的命名为PCV2。随后，PCV2由地方性流行性疾病发展为动物流行性疾病，并在全球的猪群中不断感染扩散，引发了一系列猪圆环病毒疾病（Porcine circovirus diseases，PCVDs）[3]，该病毒不仅可感染家猪群，也在野猪群中广泛传播。虽然很少出现临床症状，但其仍被认为是全球养猪业最重要的病原之一。在PCV2疫苗问世前，亦有诸多专家学者认为与猪圆环相关的疾病（PCV2-systemic disease ，PCV2-SD）的出现和传播其实与PCV2并无太多关联，而是与其他某个尚不确定的因素[4] “agent X”[5]有关。然而，也有人认为疾病爆发的主要原因并不是外来的传染源。随着PCV2疫苗的问世，PCV2被证明是引发PCV2-SD的主要原因，关于PCV2疾病爆发的“因果论”的争辩也因此结束，但对于病毒由地方流行性发展为动物流行性的原因还有待进一步的研究。

在第八次国际病毒学会议上，将脊椎动物的圆环病毒分为圆环病毒（Cir-covirus）和环病毒（Gyrovirus）两个属。

2 形态结构与理化特性

PCV是已知最小的感染哺乳动物的病毒[6]，其直径约12～23 nm[7]，呈二十面体对称，无囊膜，病毒的基因组是一条共价结合的闭环单链DNA，衣壳蛋白由单肽链组成，分子量为36 kDa。根据其基因序列、致病性和抗原性的差异，将PCV划分成PCV1和PCV2两个型。PCV对外界环境的抵抗能力较强，在72 ℃高温条件下能存活15 min，在酸性环境（如pH3）和氯仿中也能存活很长的时间。该病毒对苯酚、氧化剂、氢氧化钠和季胺类化合物等比较敏感，以上消毒剂可用于PCV的消毒[8]。PCV没有血凝活性，不能凝集猪、牛、羊、鸡等动物和人的红细胞[9]。PCV1和PCV2在理化特性方面的差异不是很明显。

3 组织培养特性

PCV能够在增殖能力旺盛、正在进行有丝分裂的PK-15细胞上复制，该病毒的复制主要依赖于处于细胞周期S期的细胞蛋白及酶[10]。Tischer等[11]将PCV2接种到没有污染PCV的PK-15单层细胞上，发现PCV2能够增殖并形成浆内包涵体或核内包涵体；接种PCV的PK-15细胞用D-氨基葡萄糖处理，对病毒DNA进入细胞核有着促进作用，增加30%的细胞感染量。Stevenson等[12]通过研究发现，适当延长PCV2在PK-15细胞上的培养时间（24 h），也可以获得良好的病毒增殖效果。除PK-15细胞外，PCV还可以在其他细胞中复制，如牛外周血单核细胞、外周血液细胞、猪骨髓细胞等。但PCV2对RK和Vero细胞的适应性比较差，且在PT、ST、PET等传代细胞系和BHK-21细胞、恒河猴肾细胞、原代胎猪肾细胞等细胞上不能增殖。Taís F.等[13]发现，如果用收毒技术（Shell vial technique）培养接种于ST细胞的PCV2，可以收到比传统培养技术更好的效果。

4 基因组特征及分型

PCV的基因组非常小而且核苷酸序列非常保守，PCV1的基因组只含有1 759 nt，PCV2基因组则分为3种：1 766 nt、1 767 nt和1 768 nt。研究表明，PCV1和PCV2可能有相同的进化起源，其中PCV1突变率是每年1.15×10-5个变异位点[14]，PCV2则是每年1.2×10-3个变异位点[15]。不同PCV2毒株之间基因序列的同源性大于96%，而PCV1相对保守，不同毒株之间核苷酸序列的同源性大于99%[16]。PCV1和PCV2核苷酸的相似性是68%，基因序列推导出的aa同源性小于76%。现预测PCV基因组含有11个潜在的开放阅读框（Open reading frames， ORFs），大部分阅读框大小相差很大，且存在部分重叠的现象。有一定同源性的开放阅读框有ORF1、ORF2、ORF3、ORF4、ORF7和ORF8，其中ORF1、ORF5、ORF7和ORF10的5-3方向均为顺时针方向，其余的ORF则为逆时针方向。

迄今，已经报道的PCV2包括4个基因亚型，即PCV2a、PCV2b、PCV2c和PCV2d。其中PCV2a和PCV2b 是主要的基因型，PCV2c亚型毒株目前只有丹麦分离并报道，而PCV2d不仅发现于中国，可能还出现在欧洲野猪群和南美洲。我国报道的PCV2分离毒株的基因型主要是PCV2a和PCV2b，其中PCV2b已成为近年来国内流行范围最广的基因型[17]。虽然PCV2b的流行与各国近年PCVDS的频繁爆发在时间和空间上可能相符，但PCV2基因型的转变仍属于PCVDS进化的未解之谜。

5 复 制

PCV依赖双链DNA （dsDNA）中间体从而完成自身复制，dsDNA 也就是人们说的复制型（Replicative form，RF）。RF是双义的，其负链主要编码ORF2和ORF3，正链主要编码ORF1。PCV的主要开放阅读框是ORF1和ORF2，其5'端和3'端分别由基因间区（Intergenic region， IR） Ori和编码终止处IR隔开。 ORF1非常保守，有研究表明，PCV1和PCV2的rep和Ori可以完全替换；比较而言，ORF2变异程度相对较大[18]。PCV主要在单核巨噬细胞中复制，是能够在哺乳动物细胞中自主复制的最小病毒，其复制主要是滚环模式。Mankertz等发现，该病毒滚环复制时正链合成的起点位于PCV1基因组ORF1与ORF2的中间区域的728～838 nt处，长111 bp。这段片段包括圆环病毒属特有的茎环结构 TAGTATTACC 或AAGTATTACC （stem-loopstructure），其顶端的保守九核苷酸基序（nonanucleotide motiof）是滚环复制的剪切位点。位于茎环结构下游还有该区域的特异性结构，即4个六聚体重复（5'-CGGCAG-3'） （ H1， H2， H3， H4 ），是病毒复制酶蛋白的结合位点。因为病毒正链的起始点和终止点都在这个保守基元中定位，所以病毒复制的关键是九核苷酸序列，该保守序列的第7和8个碱基之间被核酸酶切开，进行滚环复制。

6 编码蛋白

6.1 ORF1编码的蛋白

ORF1全长945 nt，由312 aa（PCV1）或314 aa（PCV2）组成，分子量大小为35.8 kDa，编码后可形成分子量约为36 kDa的Rep蛋白，Rep基因转录后剪辑的产物为分子量为19.2kDa的Rep'蛋白。Rep必须和Rep'相互作用才可以促进PCV的复制过程，单独启动病毒的复制是不可能的。Rep蛋白含有结合dNTPs的P环（P-loop ）结构（序列为G—GKS ）、3个糖基化位点以及与典型滚环复制（RCR）相关的3个保守基序，这些结构对维持Rep蛋白的功能非常重要，发生突变或缺失，均会影响病毒的复制。在PCV2体外感染PK-15细胞的试验中，该病毒感染后可产生10种RNA[19]，其中5种与Rep蛋白相关，分别为Rep（1 000 nt）， Rep' （750 nt）， Rep3a（280 nt）， Rep3b（280 nt）和Rep3c（470 nt），这些RNA具有相同的5'和3'端核苷酸序列。研究表明，Rep mRNA可能是病毒基因组的初始转录物，其余mRNA的功能目前尚不明了。

6.2 ORF2编码的蛋白

ORF2主要编码构成病毒衣壳的结构蛋白，即衣壳蛋白（Capsid protein， Cap），该蛋白是由60个Cap亚单位组成的二十面体[20]，包括702个核苷酸，含有233或234个aa，分子量大小约为27.8 kDa。Cap蛋白与病毒和宿主细胞结合有关，且对Rep和Rep'蛋白的复制转运起一定作用[21]。ORF2基因的启动子位于Rep基因内部的1 428～1 168 nt处，转录起始位点在1 238 nt，转录子是一个119 nt的非翻译引导序列。通过多肽扫描分析，发现PCV2 Cap蛋白上存在一个PCV共同的抗原决定簇及3个特有的抗原位点，即65-87aa， 113-139aa和193-20aa，这一特点为建立区分其它圆环病毒的PCV2的特异性血清学方法奠定了基础。Fenaux等研究发现，CP110位（P-A）和191位（R-S）氨基酸发生改变可以增强病毒的体外复制，但会减弱病毒在体内的毒力。2003年他们发现用感染性克隆构建的来自PCV1 ORF1及PCV2 ORF2重组病毒在猪体内无致病性。

7 结 语

PCV2所引发的一系列PCVDs给全球养猪业造成了严重危害。对于该病及其病原，国内外学者进行了大量的研究，对其相关疫苗的研制也取得了突破性进展[22]，接种疫苗是目前国内外防治该病最有效也是最有收益和回报的方法。但现今仍有许多问题亟待解决：如最近一种发生于接种猪群的新的疾病——急性肺水肿（Acute pulmonary edema ，APE），似乎与PCV2疫苗的接种有关[23]；国外有报道仔猪在接种55 d后分离出了PCV1，且在接种的21 d后出现肺部损伤，似乎证明PCV1也是具有致病性的[24]。因此，我们应该对PCV2的致病机理等问题进行更深入的研究，以期为推进此项研究的发展做出贡献。

参考文献：

[1] Jacobsen B， Kruege L， Seeliger F， et al. Retrospective study on the occurrence of porcine circovirus 2 infection and associated entities in Northern Germany[J]. Vet Microbiol， 2009，138：27-33.

[2] Tischer I， Gelderblom H， Vettermann W， et al.A very small porcine virus with circular single-stranded DNA[J]. Nature， 1982， 295：64-66.

[3] Segalés J. Porcine circovirus type 2 （PCV2） infections： Clinical signs，pathology and laboratory diagnosis[J]. Virus Res， 2012，164：10-19.

[4] Segalés J， Allan G M， Domingo M. Porcine circovirus diseases[J]. Anim Health Res Rev， 2005（6）：119-142.

[5] Rose N， Opriessnig T， Grasland B， et al. Epidemiology and transmission of porcine circovirus type 2 （PCV2）[J]. Virus Res， 2012，164：78-89.

[6] Segalés J， Kekarainen T， Cortey M. The natural history of porcine circovirus type 2： From an inoffensive virus to a devastating swine disease[J]. Veterinary Microbiology，2013， 165 ：13-20.

[7] Rodriguez-Cari o C， Segalés J. Ultrastructural findings in lymph nodes from pigs suffering from naturally occurring postweaning multisystemic wasting syndrome[J]. Vet Pathol， 2009，46：729-735.

[8] 贾艳艳. 猪圆环病毒2型分离鉴定、实时定量PCR方法的建立及初步应用[D].郑州：河南农业大学，2009.

[9] Allan G M， Phenix K V，Todd D， et al. Some biological and physico-chemical properties of porcine circovirus[J]. Zentralbl Veterinarmed， 1994， 41（1）：17-26.

[10] Cheung A K.Porcine circovirus： Transcriprion and DNA replicarion[J]. Virus Research，2012， 164： 46-53.

[11] Tischer I， Peters D， Rashch R， et al. Replication of porcine circovirus： Induction by glucose mine and cell cycle dependence [J]. Arch Virol， 1987， 96（1-2）：39-57.

[12] Stevenson G W， Kiupel M， Mittal S K， et al. Ultrastructure of porcine circovirus in persistently infected PK-15 cells[J]. Vet Pathol， 1999， 36（5）： 368-378.

[13] Taís F Cruz， Joo P Arau Jr. Cultivation of PCV2 in swine testicle cells using the shell vialtechnique and monitoring of viral replication by qPCR and RT-qPCR[J]. Journal of Virological Methods，2014， 196： 82-85.

[14] Cortey M， Segalés J. Low levels of diversity among genomes of Porcine circovirus type 1 （PCV1） points to differential adaptive selection between Porcine circoviruses[J]. Virology， 2012， 422：161-164.

[15] Firth C， Charleston M A. Insights into the evolutionary history of an emerging livestock pathogen： Porcine circovirus 2[J]. J Virol， 2009，83：1813-1821.

[16] Guo L J， Lu Y H，Wei Y W， et al. Porcine circovirus type 2 （PCV2）： Genetic variation and newly emerging genotypes in China [J]. Virol J， 2010（7）：273.

[17] Allan G， Krakowka S， Ellis J， et al. Discovery and evolving history of two genetically related but phenotypically different viruses， porcine circoviruses 1 and 2[J]. Virus Res， 2012，164：4-9.

[18] Beach N M， Smith S M， Ramamoorthy S， et al. Chimeric porcine circoviruses （PCV） containing amino acid epitope tags in the C terminus of the capsid gene are infectious and elicit both antiepitope tag antibodies and anti-PCV type 2 neutralizing antibodies in pigs[J]. J Virol， 2011， 85：4591-95.

[19] Chaiyakul M， Hsu K， Dardari R， et al. Cytotoxicity of ORF3 proteins from a nonpathogenic and a pathogenic porcine circovirus[J]. Journal of Virology，2010， 84： 11 440-11 447.

[20] Khayat R， Brunn N， Speir J A， et al. The 2.3-angstrom structure of porcine circovirus 2[J]. J Virol， 2011，85：7 856-7 862.

[21] Cheung A K， Greenlee J J. Identification of an amino acid domain encoded by the capsid gene of porcine circovirus type 2 that modulates intracellular viral protein distribution during replication[J]. Virus Research，2011， 155： 358-362.

[22] 刘长明，陆月华，郭龙军，等.猪圆环病毒疫苗的研究进展[J].兽医导刊，2012（2）： 55-56.

[23] Cino-Ozuna A G， Henry S， Hesse R， et al.Characterization of a new disease syndrome associated with porcine circovirus type 2 （PCV2） in previously vaccinated herds[J]. J Clin Microbiol， 2011，49 （5）：2 012-2 016.

[24] Saha D， Lefebvre D J， Ducatelle R， et al. Outcome of experimental porcine circovirus type 1 infections in mid-gestational porcine foetuses[J]. BMC Vet Res， 2011，7 （1）：64.