连豆清脉方水提液干预ANGⅡ诱导内皮细胞凋亡及Bax/Bcl-2，caspase9/XIAP mRNA表达的实验研究

周春刚，张志斌，陆 曙

(无锡中医医院中医药研究所，江苏无锡214061)

动脉粥样硬化(AS)中医病因病机复杂，但以肝、脾、肾亏虚为本，以火毒与血瘀、痰湿等浊邪为标，“热”“浊”“肾虚”是AS的基本病理因素，“清热”“泄浊”“补肾”成为治疗动脉粥样硬化的主要治则［1］。笔者在临床根据此治则处方用药取得良好效果［2-3］，经过多年积累，常以自拟“连豆清脉方”为基础方加减，药用:连翘、野料豆、赤芍、莱菔子、牡丹皮等。动脉粥样硬化的早期表现内皮损伤、内皮细胞凋亡、血管内皮功能紊乱，可能影响血压调节，导致平滑肌增生、移位、血液凝固，是血管损伤的重要机制。很多致动脉硬化因子包括氧化低密度脂蛋白、ANGⅡ、氧化应激均能诱导内皮细胞凋亡［4］，而中医药治疗动脉粥样硬化，对防治血管内皮功能紊乱的作用及机制研究已经取得一定的进展［5］。为探讨连豆清脉方防治动脉粥样硬化作用机制，笔者通过建立ANGⅡ诱导内皮细胞凋亡模型，探讨连豆清脉方对内皮细胞线粒体损伤途径的保护作用机制。

1 实验材料

1.1 细胞株 大鼠动脉内皮细胞细胞株(RAOEC R304-05)，从上海拜力生物科技有限公司购买。

1.2 药物和试剂 DMEM高糖(GIBCO)，10%FBS(GIBCO)，0.25% 胰酶(GIBCO)，Angiotensin Ⅱ5mg(美国ENZO)，Annexin V/PI双染流式细胞凋亡检测试剂盒(美国 BD)，SYBR PrimeScript RT-PCR KitⅡ试剂盒(TAKARA DRR083S)，线粒体膜电位检测试剂盒(JC-1)(KGA-601-604)。

1.3 主要仪器 流式细胞仪(美国BD)，LightCycler480 PCR仪(德国ROCHE)，二氧化碳培养箱(美国NUAIRE)。

2 实验方法

2.1 连豆清脉方水提液制备 连豆清脉方组成:野料豆 15 g，连翘 10 g，黄连 3 g，知母 10 g，赤芍 10 g，牡丹皮10 g，莱菔子10 g。水提液制备采用水提醇沉法，采用 DMEM高糖培养基定容，再以孔径为0.22 μm的微孔滤膜过滤除菌，分装，使其含生药量为50 mg/mL(原液)，－70℃贮存备用。

2.2 RAOEC细胞培养和处理 RAOEC细胞株在含有10%新生牛血清、100 U/mL青霉素、100 μg/mL链霉素的DMEM高糖培养基中培养，37℃，5%CO2的培养箱中传代培养。取对数生长期RAOEC细胞，每孔接种8×104个细胞，实验分组为未加ANGⅡ对照组，ANGⅡ(10－7mol/L)组(模型建立时ANGⅡ最佳剂量)和500 μg/mL连豆清脉方干预组(预实验取最佳剂量)，均设复孔，每个实验需重复3～4次。

2.3 流式细胞仪检测线粒体膜电位 实验在加入10－7mol/L ANGⅡ和500 μg/mL的连豆清脉方后10 h收集细胞;用PBS洗涤细胞1次，收集不多于1×106的细胞;取500 μL JC-1工作液将细胞均匀悬浮，37℃，5%CO2的培养箱中孵育15 min;室温离心收集细胞，用500 μL 1×染色结合液洗涤2次;吸取500 μL 1×Incubation Buffer重新悬浮细胞。

2.4 流式细胞仪检测细胞凋亡 取1×106个细胞，1 mL 4%多聚甲醛(PFA)固定20 min，PBS洗2次，弃上清，沉淀细胞分2管，作为Annexin V和PI单阳性对照以调节荧光补偿。每个实验组细胞用冷PBS洗2次，0.25%胰酶消化处理，Annexin V和PI标记后进行流式细胞仪检测［6］。

2.5 实时荧光相对定量检测Bax/Bcl-2，caspase9/XIAP mRNA表达 管家基因β-actin作为内参基因，β-actin上游引物序列:5'-CCTCTATGCCAACACAGTGC-3'，下游引物序列:5'-ACATCTGCTGGAAGGTGGAC-3'。Bax上游引物序列:5'-TGCTGATGGCAACTTCAACT-3'，下游引物序列:5'-GTGAGGACTCCAGCCACAAA-3'。Bcl-2上游引物序列:5'-TGAAC-CGGCATCTGCACAC-3'，下游引物序列:5'-CGTCTTCAGAGACAGCCAGGAG-3'。caspase9上游引物序列:5'-AGCCAGATGCTGTCCCATAC-3'，下游引物序列:5'-CAGGAGACAAAACCTGGGAA-3'。XIAP 上 游引物序列:5'-TCTGGTGTGAGTTCTGATAGG-3'，下游引物序列:5'-TGGATACCACTTAGCATGCTG-3'。相对定量分析采用△△CT法，△△CT法是通过Light Cycler Relative Quantification(Version 1.0)软件，假定目的基因和内参基因扩增效率相同时，扩增效率默认为 2，标准化比值计算公式采用 2-△△CT法［7］。以未加ANGⅡ对照孔细胞作为校准品(calibrator)，实验组mRNA水平与校准品mRNA水平比较的相对比值作为定量值。

2.6 统计方法 数据统计采用统计软件SPSS 11.5处理，数值用均数±标准差(±s)表示，2组间差异统计性分析采用Students T-test，P＜0.05具有统计学意义。

3 实验结果

3.1 流式细胞仪检测ANGⅡ诱导内皮细胞凋亡线粒体膜电位 结果显示，未加ANGⅡ对照组线粒体膜电位为(6.27±3.06)，10－7mol/L ANGⅡ诱导组线粒体膜电位显著降低，为(0.55±0.17)，与对照组比较差异有统计学意义(P＜0.05)，500 μg连豆清脉方干预组线粒体膜电位(4.45±2.75)，与正常对照组比较无统计学意义(P＞0.05)，而与ANGⅡ诱导组比较则差异有统计学意义(P＜0.05)，结果见表1。

3.2 流式细胞仪检测连豆清脉方干预ANGⅡ诱导RAOEC细胞凋亡 结果显示10－7mol/L ANGⅡ诱导内皮细胞24 h凋亡率为30.37% ±10.91%，500 μg连豆清脉方组具有明显的干预ANGⅡ诱导内皮细胞凋亡作用，24 h凋亡率为13.54% ±3.8%，与 ANGⅡ组比较，差异具有统计学意义(P＜0.05)，结果见表1。

表1 连豆清脉方对ANGⅡ诱导内皮细胞凋亡线粒体膜电位和凋亡率的影响(珋±s，n=4)

表1 连豆清脉方对ANGⅡ诱导内皮细胞凋亡线粒体膜电位和凋亡率的影响(珋±s，n=4)

注:与ANGⅡ组比较，#P＜0.05

组 别 线粒体膜电位 凋亡率/%正常对照组 6.27 ±3.06 14.45 ± 4.43 ANGⅡ组 0.55 ±0.17 30.37 ±10.91连豆清脉方干预组 4.45 ±2.75# 13.54 ± 3.80#

3.3 RT-qPCR荧光相对定量 Bax/Bcl-2，caspase9/XIAP mRNA表达水平 与未加ANGⅡ的对照组比较，10－7mol/L ANGⅡ组Bax和caspase9 mRNA表达水平显著上调，分别为(1.27±0.145)和(1.75±0.37)，XIAP mRNA表达亦上调，但差异无统计学意义。Bcl-2 mRNA表达水平下调，与对照组比较差异无统计学意义，500 μg连豆清脉方组与ANGⅡ组比较，Bax和 caspase9 mRNA表达水平下调，分别为(0.755±0.264)和(0.776±0.152)，差异具有统计学意义(P＜0.05)。而Bcl-2 mRNA表达水平上调，为(1.368±0.225)，与ANGⅡ组比较，差异有统计学意义(P＜0.05)。XIAP mRNA表达与ANGⅡ组表达水平差异无统计学意义(P＞0.05)，结果见表2。

表2 连豆清脉方组实时荧光相对定量Bax/Bcl-2，caspase9/XIAP mRNA表达(珋±s，n=4)

表2 连豆清脉方组实时荧光相对定量Bax/Bcl-2，caspase9/XIAP mRNA表达(珋±s，n=4)

注:与ANGⅡ组比较，#P＜0.05

Bax Bcl-2 caspase9 XIAP ANG Ⅱ组 1.270 ±0.145 0.882 ±0.098 1.750 ±0.370实验分组1.160 ±0.107 1.219 ±0.156连豆清脉方干预组 0.755 ±0.264# 1.368 ±0.225# 0.776 ±0.152#

4 讨论

细胞凋亡信号转导途径非常复杂，当前认为至少有3条途径参与凋亡发生，即死亡受体途径，线粒体途径和内质网途径［8］。研究表明，ANGⅡ诱导内皮细胞凋亡与ANGⅡ受体活化有关［9］，ANGⅡ引起线粒体细胞色素C释放，形成凋亡小体，继而procas pase 9活化，激活下游caspase 3、caspase 6和caspase 7，导致凋亡级联反应［10］。前期笔者在对ANGⅡ诱导大鼠动脉内皮细胞凋亡模型中发现，其受体AT1R和AT2R均参与ANGⅡ诱导内皮凋亡过程，死亡受体途径和线粒体途径相关分子Fas、caspase 8、Bax和caspase 9表达上调。临床应用研究发现连豆清脉方可以同时降低冠心病患者LDL-C浓度和动脉粥样硬化指数，并进一步降低hs-CRP、外周血白细胞数，具有抗动脉粥样硬化、抗炎症作用［11］。实验中发现，连豆清脉方干预后，能够抑制ANGⅡ诱导大鼠动脉内皮细胞凋亡作用，连豆清脉方能够稳定线粒体膜电位，下调促凋亡蛋白Bax和caspase 9表达，上调凋亡抑制蛋白Bcl-2表达，表明连豆清脉方可能通过线粒体途径抑制ANGⅡ诱导大鼠动脉内皮细胞凋亡。研究认为，连豆清脉方的主要中药成份连翘、黄连、知母、赤芍等能够通过不同机制对抗细胞凋亡，连翘通过增加细胞内CK活力和稳定细胞线粒体跨膜电位而抑制缺血性损伤诱导的PC12细胞的凋亡［12］，黄连及其活性成分通过抗氧化、抗炎和拮抗钙超载等作用最终减少细胞凋亡，减轻组织缺血再灌注损伤［13］，知母皂苷抑制巨噬细胞TNF2α和NO的产生，对活化巨噬细胞诱导神经细胞凋亡起保护作用［14］，赤芍总苷稳定心肌细胞膜、清除自由基和抑制心肌细胞早期凋亡［15］。连豆清脉方剂组成复杂，可能通过其抗氧化活性，降低线粒体氧化损伤，继而影响凋亡相关基因的表达，抑制ANGⅡ诱导的内皮细胞凋亡。

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