视交叉上核损毁对小鼠疼痛日节律行为的影响

张 靖，阴 彬，孙中生，彭小忠*

(中国医学科学院 1.基础医学研究所 北京协和医学院 基础学院 医学分子生物学国家重点实验室；2.神经科学中心, 北京 100005； 3.中国科学院 北京生命科学研究院, 北京 100101)

研究论文

视交叉上核损毁对小鼠疼痛日节律行为的影响

张 靖1,2，阴 彬1,2，孙中生3，彭小忠1,2*

(中国医学科学院 1.基础医学研究所 北京协和医学院 基础学院 医学分子生物学国家重点实验室；2.神经科学中心, 北京 100005； 3.中国科学院 北京生命科学研究院, 北京 100101)

目的通过建立视交叉上核(SCN)损毁实验建立小鼠节律调控中枢失能模型，观察中枢节律控制中心SCN对疼痛节律行为的影响。方法1)12 h 光照/12 h黑暗条件下观察小鼠甲醛诱导的炎性痛反应的节律波动； 2)SCN损毁建立小鼠节律中枢失能模型，观察小鼠转轮节律行为紊乱； 3)观察SCN损毁后小鼠甲醛诱导的炎性痛日节律波动特征的改变。结果1)12 h光照/12 h黑暗条件下小鼠的甲醛诱导炎性痛存在日节律波动； 2)SCN损毁后小鼠正常的炎性痛日节律波动特点明显改变，出现活动期与静息期波动峰值的反转。结论脑内的节律调控中枢SCN对小鼠炎性痛的节律波动具有中枢调控作用。

疼痛; 甲醛; 炎性痛; 视交叉上核; 日节律

疼痛是一种机制非常复杂的神经活动，也是一组复杂的生理、病理和心理改变的临床表现[1]。研究疼痛感觉随时间变化的规律和影响因素对提出救治临床“痛症”的科学用药具有重要意义。

视交叉上核(suprachiasmatic nucleus, SCN)是哺乳动物昼夜节律系统调节的中枢结构，产生对睡眠-觉醒、激素、代谢和生殖等一系列生理活动的调节，多种生理、行为活动的紊乱均与SCN功能异常有关[2- 3]。SCN一般会利用光照进行生物钟校准，但是即便在全黑环境，其内神经元也能让动物保持昼夜节律。 环境因子被称为同步器，建立在同步器上的节律时间被称为给时时间(zeitgeber time，ZT)，而持续黑暗环境则称为持续黑暗时间(consistent dark time,CT)[4- 6]。

以往研究证实，小鼠的多种疼痛行为呈现昼夜节律变化的特性，如甲醛诱导的炎性痛，以及热刺激和机械刺激的疼痛反应等[7- 8]。甲醛诱导的疼痛节律与脊髓背根结内表达的P物质的功能密切相关[7]，但是，甲醛诱导炎性痛的昼夜节律是否与SCN功能有关至今尚无证据。本研究即针对SCN对炎性痛昼夜节律的影响进行实验观察和分析。

1 材料与方法

1.1 实验动物及节律行为数据采集及分析

12周龄SPF级C57品系雄性小鼠[北京维通利华实验动物技术有限公司；合格证号:SCXK(京)2006-0009]，按照12 h光照/12 h黑暗，自由取食、饮水饲养条件喂养。光照条件驯化方案参见文献[5- 7]。动物节律行为监测：小鼠作息规律监测采用转轮自动监测系统记录。

1.2 SCN损毁手术

采用电损毁法破坏小鼠双侧SCN。SCN的脑立体定位参考已发表文献[6- 7]及小鼠脑图谱(George P，2001)，并根据采集动物样本的实测数据进行校正。SCN坐标为：前囟(bregma)后0.4 mm，中线(midline)侧0.3 mm，硬脑膜(dura)下5.1 mm。损毁电极尖端直径0.1 mm，尖端裸露0.5 mm。SCN施双侧损毁，电流1.0 mA，15 s。对照组为未实施手术组小鼠，假手术组为手术方法与损毁组相同，但损毁电极仅插入SCN上方不做电流击损。术后5～7 d，待小鼠机能状态恢复正常后进行后续实验观察。

1.3 疼痛行为学观察

经30 min测试实验环境适应后，实验组小鼠接受足底皮下甲醛(5%, 10 μL)注射，注射后立即进行疼痛行为学观察，观察方法参见文献[7]。

1.4 统计学分析

2 结果

2.1 不同光照周期条件下小鼠的节律行为

小鼠活动期为ZT12(18∶00pm)至ZT24(6∶00am)，静息期为ZT0(6∶00am)至ZT12(18∶00pm)。经全黑暗环境驯化9 d后，小鼠每日活动期起始时间点(CT12)如箭头示。全黑环境对小鼠节律的影响：其每日活动期起始时间出现了稳定漂移，小鼠内源性节律为23 h 40 min左右(图1)。

The black and white bar is shown the condition with the 12 h light-12 h dark cycle (zeitgeber time, ZT), and CT were the constant darkness condition with 9 days;CT12.the start time point of CT time for active phase in each day of mice图1 12 h/12 h明-暗同步驯化及全黑暗环境驯化9 d小鼠运动-睡眠节律Fig 1 The histograms are displayed circadian rhythm of the wheel running behavior of mice in the different light conditions

2.2 SCN损毁后小鼠转轮昼夜节律行为改变

小鼠经SCN损毁手术后，首先进行了损毁部位的形态学检测(Nissl-staining)，检测结果如图2所示。从结果中可以观察到，假手术组(sham)小鼠下丘脑部位SCN形态完整未受损伤，而手术组(surgery)小鼠的SCN已消失(图2)。

损毁SCN后，小鼠放置于转录节律检测系统进行观察记录。结果发现,术后正常光照条件下手术组小鼠依然可以保持稳定的昼夜节律行为，但是在短期(18 d)的全黑环境中手术组小鼠即表现出昼夜节律的紊乱(图3)。在CT环境中长期(112 d)观察，SCN损毁后对小鼠节律行为的影响则更为显著，且再次恢复至明暗交替给时环境，已经消失的昼夜节律仍可恢复(图4)。

2.3SCN损毁后小鼠转轮炎性痛昼夜节律产生翻转

对照组小鼠的急性伤害性行为反应在静息期(ZT4)和活动期(ZT20)之间没有显著性差异(图5A)；在手术组中，小鼠急性伤害性行为反应在静息期(ZT4)和活动期(ZT20)之间也没有显著性差异(图5B)。

但是，对照组中甲醛诱导的炎性痛具有节律波动的特点，且静息期(ZT4)比活动期(ZT20)反应强烈(图5C，Plt;0.001；F=16.1)， 这与过去的观察一致[8]。然而，手术组则呈现出了不同的特点，产生了昼夜之间疼痛反应强度的翻转：活动期(ZT20)比静息期(ZT4)反应强烈(图5D，Plt;0.01；F=5.75)。

A.morphology of SCN in three groups of naive, sham and surgery(×4); B.morphology of SCN in three groups (×10)图2 SCN损毁后小鼠下丘脑部位的形态学检测Fig 2 A complete SCN lesion result was confirmed by Nissl-staining

The bars at top or bottom represent light (gray) / dark (black) cycles or constant darkness, respectively图3 SCN损毁后小鼠置于明暗交替条件和全黑环境中转轮行为Fig 3 Wheel running activity after SCN lesion surgery

It was shown an entire disruption of the circadian rhythm of running wheel behavior in the long-term constant darkness; the red bars are shown the short outage of electric power in the monitor system

图4SCN损毁小鼠在长期全黑环境(112d)中昼夜节律丧失
Fig4WheelrunningactivityafterSCNlesionsurgeryinthelong-term(112days)constantdarkness

The histograms are displayed an overturned pattern of nociceptive responses between ZT4 and ZT20； *Plt;0.05， **Plt;0.001 compared with ZT4

3 讨论

生物钟研究领域最早认识的节律振荡器是位于脑内下丘脑部的SCN。直到今天仍习惯称之为生物钟系统的“主钟”(master clock)[2- 6]。SCN损毁实验结果表明，一旦SCN的功能丧失，大鼠各种内源性行为的昼夜节律以及激素分泌的昼夜节律随即消失，甚至连大鼠夜行性的行为规律也将遭到破坏[2- 3]。本研究也证明了SCN对于小鼠自主运动行为昼夜节律的重要调节作用，该调节作用一旦消失，小鼠则无法维持正常的昼夜节律，这一点与以往的研究结果吻合[5]。

现有的研究证据已经表明，体内生物钟系统除了下丘脑SCN起着重要的调节功能之外，其他外周器官和组织也还广泛地分布着许多局部的生物钟环路，并且也调节着重要的具体节律生理活动[4]。前期研究结果发现，正常生理条件下小鼠的甲醛诱导炎性痛存在昼夜节律，且受到背根神经结内表达的P物质的调节，这表明P物质在脊髓背根节内的节律性生成，并向突触终末的节律性运输是产生炎性痛反应昼夜节律的关键因素[7]。本研究结果表明，中枢重要的节律振荡器SCN对于维持正常的疼痛昼夜节律特征具有重要的意义，一旦功能丧失则出现昼夜颠倒的情况。

SCN影响一些外周器官的节律性功能可以依赖自主神经系统或激素调节系统，而这些系统和感觉系统的初级中枢也存在广泛的联系，甚至也影响着伤害性信息上行通路的工作[9]，因此，也可以认为这些系统可能对炎性痛反应存在复杂的影响。不过，本研究虽然从SCN损毁手术模型上观察到了小鼠炎性痛昼夜节律异常的证据，但是其背后深层次的分子生物学机制值得在未来的工作中进一步探讨。

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Suprachiasmatic nucleus lesioninduced abnormal rhythm of circadian inflammatory pain

ZHANG Jing1,2, YIN Bin1,2, SUN Zhong-sheng3, PENG Xiao-zhong1,2*

(1.State Key Laboratory of Medical Molecular Biology，Dept. of Molecular Biology and Biochemistry，Institute of Basic Medical Sciences，CAMS，Beijing 100005; 2.Neuroscience Center，CAMS，Beijing 100005;3.Beijing Institutes of Life Science, Chinese Academy of Sciences, Beijing 100101, China)

ObjectiveTo investigate the regulation of suprachiasmatic nucleus (SCN) on the inflammatory pain in mice at behavioral level.MethodsWheel running of circadian behavioral monitor system, the surgery of SCN lesion and the formalin induced nociceptive responses test were employed to analyze the synchronize and/or maintain circadian function of SCN in modulating the rhythm of inflammatory pain induced by formalin in mice.ResultsOur results showed that the formalin induced inflammatory nociceptive responses were shown a circadian oscillation pattern in resting phase (ZT4) and active phase (ZT20), and after SCN lesion, the mice were shown an overturned pattern of nociceptive responses between ZT4 and ZT20 compared with normal control.ConclusionsThe circadian synchronized function is an important regulator for maintaining normal daily fluctuation patterns of inflammatory pain induced by formalin.

pain; formalin; inflammatory pain; suprachiasmatic nucleus (SCN); circadian rhythm

2014- 03- 17

2014- 04- 15

国家自然科学基金(31370789)

*通信作者(correspondingauthor)：peng_xiaozhong@163.com

1001-6325(2014)06-0787-05

Q 522

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