mRNA电转抗CD3抗体刺激的PBMC方法的建立

胡 愉，赵 慧,2，王 准，何 维*

(1.中国医学科学院 基础医学研究所 北京协和医学院 基础学院 免疫学系 医学分子生物学国家重点实验室，北京 100005； 2.中国食品药品检定研究院 病毒三室， 北京 100050)

研究论文

mRNA电转抗CD3抗体刺激的PBMC方法的建立

胡 愉1，赵 慧1,2，王 准1，何 维1*

(1.中国医学科学院 基础医学研究所 北京协和医学院 基础学院 免疫学系 医学分子生物学国家重点实验室，
北京 100005； 2.中国食品药品检定研究院 病毒三室， 北京 100050)

目的建立信使RNA(mRNA)电转抗CD3抗体刺激的外周血单个核细胞(PBMC)的方法，为制备基因修饰CDR3δ移植型γδ T淋巴细胞，为肿瘤细胞过继治疗提供新的技术方法。方法以SpeⅠ内切酶消化重组pGEM4Z/EGFP/A64质粒，回收纯化线性化的重组质粒pGEM4Z/EGFP/A64，体外转录成mRNA；在电转参数为500 V 500 μs、400 V 500 μs或300 V 500 μs等不同条件下，转染抗CD3抗体刺激的人PBMC；用倒置荧光显微镜观察和流式细胞仪观察和分析绿色荧光蛋白的表达；台盼蓝染色计算不同电转条件下细胞的存活率，以确定mRNA电转最佳条件。结果pGEM4Z/EGFP/A64质粒经过SpeⅠ内切酶酶切，获得了线性化的质粒；体外转录得到了增强型绿色荧光蛋白(EGFP)mRNA； 与其他转染条件相比，在500 V 500 μs电转参数下转染EGFPmRNA的PBMC细胞，电转后48 h绿色荧光蛋白表达量较高；与其他转染条件相比，在500 V 500 μs电转参数下转染EGFPmRNA的PBMC细胞，电转48 h后绿色荧光蛋白表达的阳性细胞高达77%；台盼蓝染色分析不同电转条件下细胞的存活率，在细胞电转48 h后，500 V 500 μs参数电转条件下细胞存活率可以达到85%以上。结论电转参数为500 V 500 μs的条件可用于电转mRNA于抗CD3抗体扩增的人PBMC，以制备基因修饰T淋巴细胞。

信使RNA；电转；外周血单个核细胞；加强型绿色荧光蛋白

γδT细胞独特的抗原识别模式及其广谱的肿瘤杀伤活性已使其成为深受人们关注的肿瘤过继免疫治疗的候选细胞。目前，用于肿瘤过继免疫治疗的γδT细胞主要是通过体外扩增制备[1- 2]。但是，中晚期肿瘤患者或化疗后患者体内免疫抑制，导致γδT细胞数量减少和免疫活性下降，致使体外扩增γδT细胞数量受限，难以得到治疗所需量的细胞制剂。利用基因修饰的方法获得足够数量的肿瘤反应性γδ T细胞，用于肿瘤的γδT细胞特异性过继治疗，不失为获取数量充足、安全且有良好生物学功能的γδT细胞制剂的可取途径。基于RNA基因修饰淋巴细胞的过继细胞免疫治疗的研究已有报道[3- 4]。本研究拟以加强型绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescent protein,EGFP)基因为对象，建立体外转录及电转mRNA至抗CD3抗体扩增的外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cell, PBMC)中的方法，以为新型基因工程γδTCR表达细胞制备提供新的技术支持。

1 材料与方法

1.1 质粒与菌种

pGEM4Z/EGFP/A64是含EGFP基因序列的表达重组质粒，用于体外转录mRNA(布鲁塞尔自由大学Joeri L.Aerts教授惠赠)；大肠杆菌DH5α为本室保存，基因型为：supE44lacU169(80lacZM15)hsdR17recA1end1gyr96thi-1relA1, 用于质粒的扩增与转化。

1.2 试剂及试剂盒

Taq DNA聚合酶、Pfu DNA聚合酶和T4DNA连接酶(Fermentas公司)；Oligo(dT)15Primer、RNA酶抑制剂、dNTP、琼脂糖和小量质粒提取试剂盒(Promega公司)；DNA分子质量标准DL2000(大连宝生物工程有限公司)；SpeⅠ限制性内切酶(NEB公司)；胰蛋白胨、酵母提取物、琼脂粉、氨苄青霉素等均为国产优级纯或分析纯试剂；细胞裂解液(Pierce公司)；淋巴细胞分离液(TBD公司)；RPMI-1640、DMEM高糖培养基(Gibco公司)；抗CD3 抗体(UCHT1)(BD公司)；DNA片段纯化试剂盒(Axygen公司)；The mMESSAGE mMACHINE High Yield Capped RNA Transcription Kit(Ambion公司)；MinElute Reaction Cleanup 回收试剂盒和RNasey Mini Kit试剂盒(Qiagen公司)。

1.3 pGEM4Z/EGFP/A64质粒的转化

取制备好的感受态细胞100 μL大肠杆菌E.coliDH5，加入1 μL质粒，混匀，冰上放置30 min，42 ℃热休克90 s，迅速插入冰中，冰浴5 min。加入200 μL LB培养基，37 ℃ 180 r/min，振荡培养1 h，铺于含有氨卞青霉素的LB固体培养基上。37 ℃培养过夜至菌落直径为1～2 mm。

1.4 质粒的小量制备

按照Qiagen质粒小量制备试剂盒说明书进行。1.5 mL单菌落培养菌液，10 000×g离心20 s，弃上清。加5 μL RNase A和250 μL冰预冷的重悬液重悬细菌沉淀，剧烈振荡；加入250 μL新配制的裂解液，颠倒混匀，冰浴5 min，再加入350 μL冰预冷的中和液，混匀后冰上放置10 min。室温12 000×g，离心10 min，收集上清到回收柱中， 12 000×g，离心1 min，弃废液。加入700 μL洗脱液洗2遍。收集洗脱液，室温干燥后，溶解于30 μL去离子水中，用于进一步实验或-20 ℃保存备用。

1.5 线性化的pGEM4Z/EGFP/A64质粒制备

在0.5 mL离心管中加入质粒DNA 2 μg、酶切缓冲液5 μL、100×牛血清白蛋白(BSA)0.5 μL、SpeⅠ内切酶1 μL，补加去离子水至50 μL，混匀后37 ℃孵育3 h，用1%琼脂糖凝胶电泳鉴定酶切产物，DL2000作为分子质量标准。

按照MinElute Reaction Cleanup 回收试剂盒说明书操作回收线性化pGEM4Z/EGFP/A64质粒。酶切产物加入300 μL溶液ERC，混匀，加于放入2 mL收集管中回收柱上，13 000×g离心1 min，弃离出液；加750 μL洗涤液PE，13 000×g离心1 min，弃离出液；将回收柱移入新的接收管上，加10 μL EB溶液，13 000×g离心1 min，收集含DNA片段的洗脱，于-20 ℃保存备用。

1.6 体外转录及纯化EGFP mRNA

按照Ambion公司体外转录试剂盒操作说明进行。取线性化重组质粒DNA 1 μg，10×T7缓冲液2 μL, 2×NTP/CAP 10 μL, T7连接酶2 μL, 补加无RNA酶水至20 μL，将上述成分轻柔混合，简短离心后37 ℃孵育3 h，加入1 μL DNase Ⅰ于37 ℃反应15 min。

使用QIAGEN RNeasy Mini Kit，按照试剂盒操作说明纯化体外转录的mRNA。即：加入溶液1，以调整样品至100 μL，然后加入350 μL缓冲液RLT，混匀，加入250 μL无水乙醇，混匀。将上述样本转移到一个放置在2 mL的收集管上的RNeasy Mini 柱子，12 000×g离心1 min，弃离出液；加500 μL缓冲液RPE，12 000×g离心1 min，弃离出液；加500 μL缓冲液RPE，12 000×g离心2 min；将柱子转移到一个新的1.5 mL 离心管上，加入50 μL去离子水，室温静置10 min后，12 000×g离心1 min；将柱子转移到一个新的1.5 mL 离心管上，加入上一步洗脱出来的洗脱液(约45 μL)，室温静置10 min后，12 000×g离心1 min。收集洗脱液。测定260 nm的吸光度值(A260)，按照公式A260×稀释倍数×40(μg/mL)计算RNA的量。分装，-80 ℃保存备用。

1.7 抗CD3单克隆抗体扩增PBMC

RPMI-1640培养液1∶1稀释的10%肝素抗凝正常人静脉血，按常规法，用淋巴细胞分离液离心分离。吸取分离液界面乳白色单个核细胞层，RPMI-1640培养液洗涤3次，用含10% 胎牛血清的RPMI-1640培养液调整细胞浓度至2×106个/mL，备用。

500 μL内含1 μg抗CD3单克隆抗体的RPMI-1640包被24孔板，37 ℃孵育2 h。用RPMI-1640培养液洗3次, 将重悬好的PBMC加到洗涤好的24孔培养板中，1 mL/孔，加入IL-2，终浓度为200 U/mL。37 ℃ 5% CO2环境培养，约3 d后备电转用。

1.8 EGFP mRNA的转染

离心收集细胞，用OPTI-MEM洗细胞1次。细胞重悬于OPTI-MEM至终浓度2.5×107/mL。冰上放置5 min。将RNA 10 μg和200 μL细胞移入电转杯中并置入电转仪，电转参数为500 V 500 μs、400 V 500 μs、300 V 500 μs。电转完毕后，立即移入含RPMI-1640完全培养基的6孔板中继续培养。

1.9 转染细胞的鉴定

在不同的时间收集转染的细胞，倒置荧光显微镜和流式细胞仪观察和鉴定转染细胞EGFP的表达；台盼蓝染色计算不同电转条件下转染细胞的存活率。

2 结果

2.1pGEM4Z/EGFP/A64质粒的线性化及酶切鉴定

将获得的pGEM4Z/EGFP/A64质粒经过SpeⅠ内切酶酶切，获得了线性化的质粒。电泳鉴定结果如图1所示，第2泳道是环形质粒，第3泳道是单酶切后的线性质粒。

1,4.DNA markers of DL15000 and DL 2000, respectively; 2.circled plasmids; 3.plasmids linearized by Spe Ⅰ图1 线性化pGEM4Z/EGFP/A64的鉴定Fig 1 Identification of linearized plasmid pGEM4Z/ EGFP/64A

2.2 体外转录EGFP mRNA

20 μL反应体系，用1 μg线性化的质粒DNA转录并经RNeasy Mini 柱2次纯化后，得到EGFPmRNA的量在12～20 μg之间；为此进行了4个反应，共获得60 μgEGFPmRNA。

2.3 抗CD3抗体扩增人PBMC的鉴定

人PBMC经固相化抗CD3抗体扩增后，流式细胞仪检测，80%～87%为CD3+细胞(图2)。

图2 抗CD3抗体扩增人PBMC的流式细胞术检测Fig 2 Flow cytometry analysis of PBMC amplified by anti-CD3 antibody

2.4 不同条件mRNA电转染细胞效率的鉴定

在500 V 500 μs电转参数下转染EGFPmRNA的细胞EGFP表达水平明显高于在400 V 500 μs或300 V 500 μs电转参数下转染EGFPmRNA细胞EGFP表达量。而且在电转48 h后的表达水平最高(图3A)。在500 V 500 μs电转参数下电转染EGFP

mRNA 48 h后，表达EGFP的细胞比例达到77%(图3B)，明显高于在300 V 500 μs或400V 500 μs电转参数下电转染EGFPmRNA 表达EGFP的细胞比例。

在所采用的各种电转条件下，倒置相差显微镜下计数细胞存活率均在75%以上。虽然在细胞电转24 h时间点，500 V 500 μs电转参数下细胞的存活率较其他参数电转后的细胞存活率略低，但是在细胞电转48 h后，500 V 500 μs参数电转条件下细胞存活率可以达到85%以上，3种电转条件之间没有明显的差异(图4)。

3 讨论

γδT细胞因其识别抗原广泛，且识别没有主要组织性复合物(major histocompatibility complex，MHC)限制性，已成为肿瘤过继免疫治疗的候选细胞。目前，将γδT细胞用于临床不外乎以下两种策略[2,5]：一种是体内应用γδT细胞的刺激配体，使其在体内扩增或激活γδT细胞；另一种是分离γδT细胞，随后在体外大规模扩增，扩增后的γδT细胞用于肿瘤患者的过继免疫治疗。但是，中晚期肿瘤患者或化疗后患者体内免疫抑制，导致患者可提供的细胞数量减少和免疫活性下降，致使体外扩增γδT细胞数量受限，难以得到治疗所需量的细胞制剂。建立一种新的细胞制备技术势在必行。

图4 不同电转条件下电转细胞的存活率Fig 4 Comparison of the survival rates of PBMCs after EGFP mRNA electroporation under different conditions

mRNA电转技术[6]是一种非病毒非DNA的基因转移的方法，相对于质粒转染具有如下优势：首先，电转的mRNA不同于DNA转染，它只在宿主细胞的胞质中表达，能够用于许多质粒转染难以表达的细胞如原代的T细胞进行基因修饰； 再者，稳定的mRNA不含病毒启动子，不需要对细胞具有毒性的转染试剂，不必清除细菌污染物，电转的信使RNA较为安全；此外，mRNA电转后，细胞具有较高的存活率。本实验结果很好地证明了这一优势。但是，mRNA的电转条件与质粒电转条件相反，在低电压的宽波下才能成功。最终成功获得了mRNA电转的优化条件，电转EGFPmRNA入原代PBMC，获得了77%的高表达率，以及80%以上的细胞存活率。值得注意的是，获得足够量的RNA是本技术的前提，因此，如何在体外获得足够量的成熟mRNA至关重要。采用体外转录完整mRNA的体系，不失为一值得选择的方法。

总之，建立的体外转录及电转mRNA至抗CD3抗体刺激的PBMC的优化条件，可成功地重塑细胞，表达转入的外源基因。该技术为未来制备表达肿瘤反应性CDR3移植γδTCR的新型基因工程细胞制备提供新的技术支持。

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Establishment of an electroporation method fortransfection of mRNA into anti-CD3 antibody stimulated human PBMC

HU Yu1, ZHAO Hui1,2, WANG Zhun1, HE Wei1*

(1.Dept of Immunology, Institute of Basic Medical Sciences, CAMS amp; School of Basic Medicine, PUMC；State Key Laboratory of Medical Molecular Biology, Beijing 100005; 2.National Institutes for Food and Drug Control, Beijing 100050，China)

ObjectiveTo establish an electroporation method to transfect mRNA into human PBMCs for the preparation of CDR3-grafted γδ T lymphocytes.MethodsLinearized plasmids pGEM4Z/EGFP/A64 containing EGFP cDNA fragment by the digestion with restriction endonucleaseSpeⅠ were used as templates forEGFPmRNA transcription.EGFPmRNA was transfected into anti-CD3 antibody-stimulated human PBMC by electroporation instrument under different conditions with 500 V and 500 μs, 400 V and 500 μs or 300 V and 500 μs, respectively. The levels of EGFP expression in the cells electroporated withEGFPmRNA were evaluated through inverted fluorescence microscope and flow cytometry. The survival rates of transfected-cells were measured by trypan blue staining.

ResultsAgarose electrophoresis showed that pGEM4Z/EGFP/A64 plasmids were well linearized bySpeⅠ digestion andEGFPmRNAs were successfully transcribedinvitro. 48 hours after mRNA-transfection, EGFP expression in cells transfectedEGFPmRNAs under the condition of 500 V and 500 μs attained 77% which were significantly higher than those in cells transfectedEGFPmRNAs under other conditions. The survival rate of transfected cells under the condition of 500 V and 500 μs reached up to 85%.ConclusionsThe electroporation platform of mRNA transfection into human PBMC with parameters of 500 V and 500 μs is successfully established and may be useful to prepare genetically modified T lymphocytes by mRNA transfection.

mRNA; electroporation; PBMC; EGFP

2014- 03- 19

2014- 04- 11

国家高技术研究发展计划(863计划)(2012AA020901)

*通信作者(correspondingauthor)：mianyi333@163.com

1001-6325(2014)06-0782-05

R 392.12

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