不同碳源对重组毕赤酵母表达嗜热β-半乳糖苷酶的影响

李洪波，郭祥前，陈 静，龙 腾，张子政

(怀化学院1.生命科学系;2.民族药用植物资源研究与利用湖南重点实验室，湖南 怀化 418008)

β-半乳糖苷酶(EC3.2.1.23)学名为β-D-半乳糖苷半乳糖水解酶，常用名为乳糖酶，广泛存在于各种动物、植物、微生物中，可催化乳糖分解成一分子的葡萄糖和一分子的半乳糖[1，2].利用乳糖酶水解乳制品中的乳糖，可将乳糖含量降低70%-80%，解决乳糖不耐症患者的乳品消费问题[2-4].热稳定性好的β-半乳糖苷酶具有较高的开发价值，目前多数耐热β-半乳糖苷酶的最适温度在60℃以上，高温下热稳定性良好，能够有效降低生产工艺中微生物污染的风险[5].嗜热β-半乳糖苷酶主要来源于高温菌，已有许多研究报道表明通过基因重组技术，将嗜热β-半乳糖苷酶基因导入适合的宿主细胞，可以高效地产生热稳定性好的重组β-半乳糖苷酶[6-8].碳源是影响重组蛋白在组成型毕赤酵母中分泌表达水平的最主要因素.本研究分别以葡萄糖、果糖、丙三醇、乳糖、蔗糖、麦芽糖六种碳源，分析碳源对组成型重组酵母分泌表达源自嗜热菌Pyrococcus furiosuβ-半乳糖苷酶的影响，确定组成培养基的最佳碳源.

1 材料与方法

1.1 材料

表达嗜热菌Pyrococcus furiosuβ-半乳糖苷酶的组成型毕赤酵母转化子由佛罗里达大学李侍武教授馈赠，胰蛋白胨及酵母提取物购自OXIOD公司，YP 液体培养基包含1%酵母提取物和2%蛋白胨(添加1.8%琼脂即为YP 固体培养基).邻-硝基酚-β-D-半乳糖苷 (ONPG)、考马斯亮蓝G-250 及小牛血清(BSA)购自Sigma公司.葡萄糖、丙三醇、果糖、蔗糖、麦芽糖和乳糖为国产分析纯.

1.2 方法

1.2.1 碳源对菌体生长速度的影响

将重组酵母转接至含2%葡萄糖的YP 固体培养基平板活化，28℃培养3 d，挑取重组酵母转化子单菌落接种至含2%葡萄糖的YP 液体培养基中，28℃、200 rpm 培养36 h.按2%的接种量分别接至含2%以下6种碳源的YP 液体培养基中:葡萄糖、丙三醇、果糖、蔗糖、麦芽糖和乳糖，28℃、200 rpm 摇床培养4 d，每24 h 取样一次.测定在λ =600 nm 处测定待测液菌体浓度.设毕赤酵母出发菌株在果糖中的培养为对照.

1.2.2 碳源对重组酵母分泌蛋白的影响

分别取在不同碳源条件下的发酵液上清，以牛血清白蛋白为标品，采用Bradford 法测定蛋白浓度，蛋白浓度测定方法参照文献进行[9].

1.2.3 测定相对酶活

采用邻硝基苯酚法测定酶活，参照标准进行[9]，分别取样品上清100 μL，快速加入1.4 mL 0.25% ONPG溶液，立即摇匀将样品置于65℃水浴锅中水浴3 min.立即加入0.5 mL NaCO3溶液终止反应.空白对照为加入待测液后先加入NaCO3溶液，后加入ONPG 溶液，同样水浴3 min 后，以空白为对照，在分光光度计λ =420 nm 处测定各样品的OD值.以酵母出发菌株在2%葡萄糖的YP 液体培养基中培养的菌液上清为对照.

1.2.4 目标蛋白的SDS-PAGE 分析

取不同碳源在不同培养时间下的重组酵母发酵液上清液TCA 沉淀后，100%乙醇洗涤蛋白沉淀3次，含8 M 尿素的PBS 溶解蛋白沉淀，加入SDS 上样缓冲液，煮沸热变性5 min，12% SDS-PAGE 电泳分析.

2 结果与分析

2.1 碳源对菌体生长速度的影响

不同碳源下菌体生长曲线如图1所示，丙三醇中的酵母菌体浓度最高，麦芽糖最低.丙三醇中的酵母第1 d 即进入对数期，第2-4 d 维持在稳定期，菌体浓度在培养4 d 时为各碳源最高;果糖、葡萄糖及丙三醇的菌体生长曲线趋同.以蔗糖、乳糖及麦芽糖为碳源，培养2 d 内处于停滞期，之后进入对数期;以蔗糖为碳源于第3 d 进入稳定期，以麦芽糖和乳糖为碳源，培养4 d 后仍处于菌体生长的对数期.菌体生长曲线说明，单糖和丙三醇为碳源，菌体的生长明显快于双糖，当以乳糖和麦芽糖为碳源时菌体生长的停滞期和以数生长期最长.出发菌株在果糖中的生长曲线和菌体浓度与重组酵母在果糖中的情况基本一致.在不同碳源中，重组酵母菌的菌体生长情况是:丙三醇＞果糖＞葡萄糖＞蔗糖＞麦芽糖＞乳糖.

图1 不同碳源下酵母的菌体生长曲线

2.2 碳源对重组酵母分泌目标蛋白的影响

不同碳源培养的培养基上清中的总蛋白浓度如图2所示，以葡萄糖、果糖和丙三醇为碳源，酵母分泌的总蛋白在第2 d 迅速上升，之后维持在一个相对稳定的水平;乳糖在1-2 d 蛋白浓度较低，而3-4 d 总蛋白浓度迅速上升，并与上述3种碳源达相近水平.以麦芽糖和蔗糖为碳源时，发酵液中的总蛋白浓度在4 d 内均处于较低水平.菌体分泌蛋白的曲线说明，单糖和丙三醇为碳源菌体，发酵液中的总蛋白浓度较高，重组酵母菌分泌蛋白的能力在3种碳源中相近，当以乳糖为碳源，在培养的第4 d 达到与以上3种碳源接近的水平，当以麦芽糖和蔗糖为碳源时在培养时间范围内，重组酵母转化子仅能分泌少量蛋白.

图2 不同碳源下样品的总蛋白浓度

2.3 碳源对重组酵母分泌β-半乳糖苷酶酶活的影响

由图3可知，除毕赤酵母出发菌株的酶活始终很低外，6种碳源都能使重组酵母分泌β-半乳糖苷酶.在培养的第1 d，葡萄糖为碳源酶活最高，而第2 d 果糖为最高;果糖的酶活在第4 d 有所下降，葡萄糖从3 d 开始，酶活稍有下降;以丙三醇为碳源，在培养的4 d 内，酶活一直在增加，但其酶活要低于果糖和葡萄糖.当以蔗糖、麦芽糖和乳糖双糖为碳源时，酶活在培养时间内始终处于较低水平，且总体稳定，没有明显增加.酶活测定结果表明，果糖是6种碳源中最好的碳源，其次是葡萄糖和丙三醇;蔗糖、麦芽糖和乳糖双糖在培养重组酵母时，其分泌的β-半乳糖苷酶酶活较低.

图3 不同碳源下β-半乳糖苷酶的相对酶活力

图4 不同碳源下目标蛋白的SDS-PAGE 图谱

2.4 不同碳源对重组酵母分泌目标蛋白的SDS-PAGE 分析

重组嗜热菌Pyrococcus furiousβ-半乳糖苷酶的分子量大约为60 kDa，出发菌株以果糖为碳源的蛋白分泌和重组酵母菌株在6种碳源中的蛋白分泌情况的SDS-PAGE 结果如图4所示.从SDS-PAGE 结果可以看出，出发菌株以果糖为碳源其培养基上清0、1、2、3、4 d 样品在目标位置未出现明显的特异蛋白条带;当以果糖为碳源时，其培养基上清在培养前没有特异条带，在培养的1、2、3、4 d 中，60 kDa 处出现特异蛋白条带，该条带在培养的第1 d 就已经非常明显;当以葡萄糖为碳源时，其培养基上清在培养前没有特异条带，在培养的1、2、3、4 d 中，60 kDa 处出现特异蛋白条带，该条带在培养的第1 d 就已经较明显并持续增加到第4 d;当以丙三醇为碳源时，其培养基上清在培养前没有特异条带，在培养后，60 kDa 处出现特异蛋白条带，该条带在培养的第1 d 就已经较明显并持续加到第4 d;当以蔗糖、麦芽糖和乳糖双糖为碳源时，60 kDa 处出现特异蛋白条带，但始终较弱.SDS-PAGE的检测结果与酶活测定结果基本吻合.SDS-PAGE 结果同样表明，以单糖和丙三醇为碳源时，β-半乳糖苷酶的分泌不平要明显高于双糖.

3 讨论

目前，商用乳糖酶以耐热性较差的胞内酶为主，这些胞内酶的产率低并且分离纯化过程比较复杂，使得商业用乳糖酶的市场价格较昂贵.从食品安全性考虑，在乳业生产上加入低温酶容易引起污染，存在食品质量安全隐患.耐高温乳糖酶在100℃经几十分钟甚至数小时热处理仍保持很高的活性，并且在高温条件下，乳糖更易水解.牛乳消毒主要采用巴氏消毒法或高温瞬时消毒法，耐高温酶在上述消毒甚至灭菌条件下仍能满足去除乳糖的要求，耐高温乳糖酶的产业化前景广阔[10-13].本研究主要分析碳源对组成型重组酵母分泌源自嗜热菌Pyrococcus furiosuβ-半乳糖苷酶的影响，结果发现重组毕赤酵母在不同碳源下分泌表达重组β-半乳糖苷酶的能力存在明显差异，并得出6种碳源中果糖为酵母产β-半乳糖苷酶的最佳碳源，葡萄糖、丙三醇次之，且单糖碳源要优于双糖，毕赤酵母生长与β-半乳糖苷酶合成同步，在生长的对数期酶活力最高.

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