氟尿嘧啶植入剂对大肠癌患者外周血survivin、caspase-3、CD44V6的影响*

颜丽萍 管小倩 田小林 石晓萍 李 弘

大肠癌是世界范围内最常见的消化道恶性肿瘤之一，我国大肠癌的发病率和病死率位居恶性肿瘤的第4位，且呈逐年上升趋势[1]。目前，外科手术治疗仍然是大肠癌的最主要治疗方法。但是仍有一部分患者在接受了根治性手术后，出现了局部复发和转移。根治术后患者5年生存率在50%左右，总体疗效并未明显改善。间质化疗可以将抗癌药物制备成缓释剂型局部植入，从而达到局部持久化疗，降低大肠癌的复发及转移，还可避免全身不良反应[2-3]。本研究旨在通过检测氟尿嘧啶植入剂对大肠癌患者外周血survivin、caspase-3、CD44V6的影响，探讨其抑制肿瘤生长及转移的机制。

1 资料与方法

1.1 一般资料 2012年3月—2013年4月桂林市第二人民医院和桂林医学院附属医院普外科收治的结直肠癌患者64例，男37例，女27例。纳入标准：术前未行化疗、未使用免疫抑制剂，无手术禁忌证可按常规行根治性手术。将64例患者按随机数字表法分为治疗组和对照组，每组32例。治疗组在手术结束前根据肿瘤部位将氟尿嘧啶植入剂均匀植入瘤床、肿瘤病灶区域、对应的肠系膜血管根部和相应淋巴回流区域，表面喷洒生物蛋白胶固定，植入范围距吻合口至少4 cm以上，总剂量为600 mg；对照组行根治术后不植入任何药物。2组均按《NCCN肿瘤学临床实践指南》的要求进行术后静脉化疗。2组临床资料差异无统计学意义（P＞0.05），见表1。

Table 1 Comparison of clinical data between two groups表1 2组临床资料比较 （n=32）

1.2 方法

1.2.1 标本制备 所有患者均于术前1 d和术后14 d清晨空腹时静脉采血2 mL，置于EDTA抗凝管，4℃冰箱保存。

1.2.2 主要试剂 RNApure超纯总RNA快速提取试剂盒、逆转录、PCR试剂盒均购于北京艾德莱生物科技有限公司。引物均由invitrogen公司合成。CD44var（v6）（FITC）标记的鼠抗人单克隆抗体购于eBioscience，阴性对照FITC Mouse IgG1,κ Isotype Ctrl购于BioLegend。检测仪器采用美国BD公司生产的FACSAriaTMⅢ型流式细胞仪。氟尿嘧啶植入剂（散剂，商品名：中人氟安，芜湖中人科技有限公司，批号20010826，规格100 mg/瓶）。

1.2.3 RT-PCR测定外周血survivin、caspase-3的表达 用红细胞裂解液破坏红细胞进行外周血单个核细胞富集。利用RNApure超纯总RNA快速提取试剂盒提取外周血总RNA，RT-PCR扩增目的基因survivin、caspase-3和内参基因β-ac⁃tin。引物序列：survivin 上游5＇-GTCCCTGGCTCCTCTACTG-3＇，下游5＇-GACGCTTCCTATCACTCTATTC-3＇，扩增长度 174 bp；caspase-3 上游 5＇-AGAACTGGACTGTGGCATTGAG-3＇，下游 5＇-GCTTGTCGGCATACTGTTTCAG-3＇，扩增长度 191 bp；β-actin 上游5＇-AGAGCCTCGCCTTTGCCGAT-3＇，下游5＇-TGCCAGATTTTCTCCATGTCGT-3＇，扩增长度 313 bp。sur⁃vivin、caspase-3及β-actin的扩增条件为：预变性94℃3 min，变性94℃ 30 s，退火55.2℃ 30 s，延伸72℃ 30 s，30次循环，终延伸72℃5 min。Marker长度为600 bp。PCR产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳分离和EB染色后，紫外灯下显影拍照。

1.2.4 流式细胞仪测定外周血CD44V6的表达 2个1.5 mL的EP管分别取100 μL抗凝血样本，A管加入10 μL抗体，B管加入0.5 μL同型对照，室温25℃避光孵育30 min。两管分别加入已配好的900 μL溶血素（用去离子水稀释为1∶100），室温25℃避光孵育30 min。直至肉眼可见溶血透明。4℃ 2 000 r/min离心10 min。弃上清，500 μL PBS重悬洗涤2次。300 μL PBS将细胞重悬后，过滤上机。

1.3 统计学方法 采用SPSS 16.0统计软件分析处理数据。计量数据用均数±标准差（x±s）表示，组内比较用配对设计t检验，组间比较用完全随机设计的两样本t检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 外周血survivin和caspase-3的表达结果 术前2组survivin和caspase-3的表达差异无统计学意义（P＞0.05）；术后治疗组和对照组survivin的表达均明显低于术前，且治疗组survivin的表达低于对照组（P＜0.05）；术后治疗组和对照组caspase-3的表达均明显高于术前，且治疗组caspase-3的表达高于对照组（P＜0.05），见表2、图1。

Table 2 The expressions of surviving and caspase-3 before and after surgery in two groups表2 各组手术前后survivin、caspase-3的表达 （x±s）

2.2 外周血CD44V6的表达结果 术前2组CD44V6的表达差异无统计学意义（P＞0.05）；术后治疗组和对照组CD44V6的表达均明显低于术前，且治疗组CD44V6的表达低于对照组（P＜0.05）,见表3、图2。

Table 3 The expression of CD44V6 before and after surgery in two groups表3 各组手术前后CD44V6的表达 （x±s）

Figure 2 The flow cytometry scatter plot of CD44V6 in two groups图2 CD44V6的流式细胞术散点图

3 讨论

在肿瘤的发生发展过程中，细胞凋亡调控失衡发挥着重要作用。1997年Ambrosini等[4]首先分离出来了survivin基因，它是目前发现的最强的一种凋亡抑制因子，也是迄今为止唯一可通过内源性抑制caspase活性而抑制细胞凋亡的因子。Shin等[5]研究发现，细胞周期的G2/M阶段，主要是由survivin抑制凋亡来保证正常的细胞分裂。它与caspase-3一起定位于中心体的微管上，可直接作用于caspase-3和caspase-7，并抑制其活性，从而引起细胞凋亡。研究表明，survivin可通过抑制癌细胞凋亡促进癌细胞增殖及肿瘤新生血管生成而在大肠癌的发生发展中发挥重要作用。而通过以survivin为靶点可诱导肿瘤细胞凋亡，抑制肿瘤的生长，也可加强化疗药物的作用[6-7]。本研究表明，氟尿嘧啶植入剂可通过明显抑制survivin的表达，上调caspase-3的表达来促进肿瘤细胞凋亡，实现其治疗恶性肿瘤的作用。

CD44V6为目前比较公认的肿瘤转移促进基因。它参与了3个肿瘤侵袭转移的过程：肿瘤细胞与血管或淋巴管内皮细胞之间、肿瘤细胞与基膜之间、肿瘤细胞穿出基膜与器官组成细胞之间的黏附。较多研究报道，CD44V6的高表达是肿瘤高侵袭、易转移的指标[8-9]。研究发现，大肠癌中CD44V6的高表达赋予癌细胞较强的侵袭转移能力，可以作为预测大肠癌侵袭转移的一个有效指标[10-11]。本研究结果显示，2组术后14 d的CD44V6表达明显低于术前，且治疗组CD44V6的表达又低于对照组。笔者认为，氟尿嘧啶植入剂能够在给药区域长时间稳定维持较高的药物浓度，杀死术中未切除的残留病灶、微小转移灶及腹腔游离癌细胞，术中给药可明显降低术后大肠癌患者的复发及转移，有助于改善其预后。

Figure 1 Electrophoresis of survivin and caspase-3 in two groups图1 survivin和caspase-3的RT-PCR电泳图

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