沉默Bmi-1基因表达对人小细胞肺癌细胞H1963增殖与侵袭的抑制作用Δ

饶进军，何关生，毛楠，吕琳，腊蕾（.南方医科大学药学院，广州5055；.广州医科大学附属第二医院药学部，广州 5060；.广州市番禺中心医院药学部，广州 5400；4.南方医科大学附属南方医院药学部，广州 5055）

小细胞肺癌（Small cell lung cancer，SCLC）属肺癌的一种未分化型，发病率约占肺癌的15%～20%，具有分裂指数高、倍增时间短、侵袭能力强等特点；确诊时大多已出现远处转移，失去手术治疗机会[1]。铂类联合依托泊苷是当前治疗SCLC的一线方案，但由于对药物的耐受以及肿瘤细胞的高转移率，临床治疗效果很不满意，患者的平均生存期仅有15～20个月[1]。Bmi-1属多梳基因（Polycomb group genes，PcG）家族，具有遏制抑癌基因表达（如INK4a/ARF）、诱导细胞恶性转化、维护肿瘤干细胞更新及促进癌细胞侵袭转移等作用，被认为是肿瘤恶性标记之一[2]，是一个潜在的抗肿瘤新靶点，目前已被试用于多种肿瘤[3-4]。近来研究发现，98.4%的SCLC病例Bmi-1呈现过表达，显示Bmi-1在SCLC细胞的生长繁殖中有重要作用[5]，但对于Bmi-1能否作为治疗SCLC的靶点，目前尚未见报道。本研究拟以人SCLC细胞H1963作为研究对象，通过小分子干扰RNA（siRNA）转染Bmi-1得到沉默Bmi-1基因，研究沉默Bmi-1基因对H1963细胞增殖与侵袭的抑制作用，以期为SCLC的治疗提供新思路和新方法。

1 材料

1.1 仪器

倒置显微镜（日本Nikon公司）；5810R型高速离心机（德国Eppendorf公司）；M680型酶标仪、蛋白质印迹法（Western Blot）印迹转移电泳仪系统（美国Bio-Rad公司）；FACS Calibur型流式细胞仪（美国BD公司）。

1.2 药品与试剂

F12K培养基、胎牛血清（美国Gibco公司）；siRNA（广州锐博生物科技有限公司，纯度：99.9%）；阳离子脂质体Lipofectamine RNA imax（美国 Invitrogen公司）；MTT（美国Sigma公司）；细胞周期检测试剂盒（武汉碧云天生物技术研究所）；Matrigel基质胶（美国BD公司）；兔抗人Bmi-1、抑癌基因（P16、P14）和上皮型钙黏蛋白（E-cadherin）、神经型钙黏蛋白（N-cadherin）、波形蛋白（Vimentin）、基质金属蛋白酶2（MMP-2）、基质金属蛋白酶组织抑制因子1（TIMP-1）、β-肌动蛋白（β-actin）单克隆抗体和辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG（IgG-HRP）二抗（美国CST公司）；增强化学发光（ECL）试剂盒（美国Milipore公司）；其余试剂均为国产分析纯。

1.3 细胞

H1963细胞株购自中国科学院上海细胞库。

2 方法

2.1 细胞培养与siRNA干扰

H1963细胞常规培养于含10%胎牛血清的F12K培养基中，取对数生长期细胞经胰酶消化，按每孔1.5×105个接种于6孔板，每孔5×103个接种于96孔板。siRNA转染Bmi-1基因序列为5′-GGGAAAGUGUAUGAUAAAUTT-3′、阴性对照序列Neg-siRNA为5′-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3′，以《广州锐博生物科技有限公司siRNA产品说明》推荐的siRNA剂量（100 nmol/L），按照lipofectamine RNA imax操作说明书进行转染。

2.2 Western blot法检测siRNA对H1963细胞Bmi-1的基因沉默效果

取“2.1”项接种于6孔板的细胞，随机分组，每组3个复孔，即试验组（100 nmol/L特异性Bmi-1的siRNA转染）、阴性对照组（100 nmol/L Neg-siRNA转染）和空白对照组。细胞转染48 h后分别提取细胞总蛋白，以二喹啉甲酸（BCA）法测定浓度。十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶（SDS-PAGE）电泳分离总蛋白后，半干法转印至PVDF膜上，于含5%脱脂奶粉的TBST缓冲液中室温封闭1 h，以1∶1000稀释比例的一抗4℃孵育过夜。TBST缓冲液洗涤5 min×3次后用1∶2 000稀释的IgG-HRP二抗室温孵育1 h，TBST缓冲液洗膜5 min×3次，ECL显色后，X光胶片曝光成像。将胶片进行扫描，蛋白表达强度用目的蛋白条带的灰度和内参β-actin蛋白条带灰度的比值表示，蛋白条带灰度采用Gel-Pro analyzer 4.0软件进行分析。

2.3 MTT法检测沉默Bmi-1基因对细胞增殖能力的影响

取“2.1”项接种于96孔板的细胞，随机分组同“2.2”项，每组6个复孔。各组细胞在转染后1、2、3、4、5 d分别每孔加MTT（5 mg/ml）10 μl，4 h吸出孔内液体，每孔加入二甲基亚砜（DMSO）150 μl，震荡10 min后检测570 nm波长下的光密度（OD）值，并按公式计算抑制率（%）＝（1－给药组平均OD值/空白对照组平均OD值）×100%。

2.4 流式细胞仪检测沉默Bmi-1基因对细胞周期分布的影响

取“2.1”项接种于6孔板的细胞，随机分组同“2.2”项，每组3个复孔。各组细胞转染48 h后，收集细胞，磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤，调整细胞浓度为2×105L－1后用70%乙醇4℃保存过夜，PBS洗去固定液后，加入500 μl碘化丙啶染色液，37℃避光30 min，流式细胞仪检测细胞周期分布情况。

2.5 Transwell侵袭试验检测沉默Bmi-1基因对细胞侵袭能力的影响

取“2.1”项接种于6孔板的细胞，随机分组同“2.2”项，每组3个复孔。各组细胞转染48 h后胰酶消化成单个细胞，无血清的F12K培养基洗2次，调整细胞浓度为3×105ml－1。将Matrigel胶（预先以DMEM培养基按1∶8稀释）按每孔50 μl均匀铺于Transwell小室中，在上室加入100 μl细胞悬液，在下室加入600 μl含10%胎牛血清的F12K培养基。培养24 h后，取出上室用棉签将未迁移过去的上室内表面的细胞轻轻拭去，甲醇固定细胞，结晶紫染色，倒置显微镜下取5个视野（×200）计数穿膜细胞平均值。

2.6 Western Blot法检测沉默Bmi-1基因对P16、P14、E-cadhe-rin、N-cadherin、Vimentin、MMP-2、TIMP-1蛋白表达的影响

取“2.1”项接种于6孔板的细胞，随机分组同“2.2”项，每组3个复孔。各组细胞转染48 h后提取总蛋白，按“2.2”项下方法检测抑癌基因（P16、P14）和侵袭相关蛋白（E-cadherin、N-cadherin、Vimentin、MMP-2、TIMP-1）表达。

2.7 统计学处理

3 结果

3.1 细胞Bmi-1的基因沉默效果

转染48 h后，与空白对照组和阴性对照组比较，试验组H1963细胞中Bmi-1蛋白表达量下调80%，差异具有统计学意义（P＜0.05），表明siRNA能有效沉默细胞中的Bmi-1基因表达。各组细胞中Bmi-1蛋白表达的电泳图见图1。

3.2 细胞增殖情况

与阴性对照组比较，试验组细胞在转染3、4、5 d时的增殖抑制率明显升高（P＜0.05或P＜0.01），其中3 d时增殖抑制率最高[增殖抑制率为（63.61±6.97）%，P＜0.01]，表明沉默Bmi-1基因可显著抑制H1963细胞的增殖。各组细胞的增殖抑制率比较见图2。

图1 各组细胞中Bmi-1蛋白表达的电泳图Fig 1 Electrophoretogram of protein expression of Bmi-1 in each group

图2 各组细胞的增殖抑制率比较Fig 2 Comparison of the inhibitory effect of cell in each group

3.3 细胞周期分布情况

与空白对照组和阴性对照组比较，试验组细胞在G0/G1期的比例明显增加（P＜0.05），S期、G2/M期的比例明显减少（P＜0.05），表明沉默Bmi-1基因可使H1963细胞发生G1/S期阻滞。各组细胞的周期分布见表1。

表1 各组细胞的周期分布（±s，n＝3）Tab 1 Distribution of cell cycle in each group（±s，n＝3）

表1 各组细胞的周期分布（±s，n＝3）Tab 1 Distribution of cell cycle in each group（±s，n＝3）

与空白对照组和阴性对照组比较：＊P＜0.05vs.blank control group and negative control group：＊P＜0.05

组别空白对照组阴性对照组试验组细胞比例，%G2/M 24.97±0.75 25.56±1.01 14.36±1.09＊G0/G1 48.69±0.83 46.77±0.95 69.72±1.25＊S 26.34±0.91 27.71±0.84 15.92±0.89＊

3.4 细胞侵袭能力变化

空白对照组、阴性对照组和试验组穿透基底膜的细胞数分别为（222±51）、（204±44）、（53±17）个，试验组侵袭细胞数明显低于空白对照组和阴性对照组（P＜0.01），表明沉默Bmi-1基因可使细胞侵袭能力显著降低。各组细胞穿透基底膜的显微镜图见图3。

3.5 细胞抑癌基因P16、P14的表达情况

与空白对照组和阴性对照组比较，试验组细胞的P16、P14蛋白表达分别升高180%、320%，表明沉默Bmi-1基因可显著上调抑癌基因P16、P14表达。各组细胞中P16、P14蛋白表达的电泳图见图4。

3.6 细胞E-cadherin、N-cadherin、Vimentin、MMP-2、TIMP-1蛋白的表达情况

与空白对照组和阴性对照组比较，试验组细胞的E-cadherin、TIMP-1蛋白表达量分别上调110%、210%，N-cadherin、Vimentin、MMP-2蛋白表达量分别下调70%、40%、80%，差异具有统计学意义（P＜0.05），表明沉默Bmi-1基因可显著影响细胞侵袭能力的相关蛋白表达，电泳图见图5。

图3 各组细胞穿透基底膜的显微镜图（×200）Fig 3 Micrograph of cells penetrating the basement membrane in each grou（p×200）

图4 各组细胞中P16、P14蛋白表达的电泳图Fig 4 Electrophoretogram of protein expression of P16 and P14 in each group

图5 各组细胞中E-cadherin、N-cadherin、Vimentin、MMP-2、TIMP-1蛋白表达的电泳图Fig 5 Electrophoretogram of protein expression of E-cadherin，N-cadherin，Vimentin，MMP-2 and TIMP-1 in each group

4 讨论

当前关于肺癌的药学研究大多聚焦于非小细胞肺癌，而研究SCLC的很少。固然SCLC发病率远低于非小细胞肺癌，但由于其增殖快、侵袭力强、致死率极高，且近年来有逐渐增多的趋势，因此已成为严重危害人类生命的一类恶性肿瘤。鉴于现有的治疗方案效果都很不理想，寻找新的作用靶点就成为治疗SCLC的关键。

本研究结果显示，沉默Bmi-1基因能显著抑制H1963细胞的增殖，表明Bmi-1有望成为治疗SCLC的一个新靶点。Bmi-1作为Polycomb抑制复合物1（PRC1）的核心亚基，与Ring1B协同催化组蛋白H2A-K119泛素化，使得染色质处于收紧状态，抑制转录因子对DNA的作用，同时还抑制转录的延伸过程[4]，最终导致基因表达的抑制。重要的抑癌基因INK4a/ARF就是Bmi-1主要的靶基因[6]。INK4a/ARF基因编码P16、P14抑癌蛋白，是维持细胞周期平衡、调节细胞增殖与衰老的关键基因[7]，一旦该基因受抑或缺失会使细胞发生恶性转化[8]。本研究发现，沉默Bmi-1基因可使P14、P16表达升高和细胞周期的G1/S期阻滞，说明干扰Bmi-1后产生的抑癌作用与其激活INK4a/ARF、阻滞细胞周期有关，不过是否还通过其他环节产生抑癌作用，则尚待进一步考证。

Bmi-1不仅参与恶性肿瘤的发生发展，还参与肿瘤的侵袭转移[9-10]。Bmi-1对Snail、Twist、ZEB1具有稳定、激活和协同作用，并由此诱导细胞发生上皮-间充质转化（Epithelial-mesenchymal transition，EMT），增强细胞迁移侵袭能力。

近来研究发现，沉默Bmi-1基因能逆转鼻咽癌、头颈鳞状细胞癌的EMT，减少其侵袭转移[11-12]。本研究通过Transwell小室试验发现沉默Bmi-1对H1963细胞有明显的抗侵袭转移作用，这一结果更进一步提升了Bmi-1抗SCLC的应用价值。

根据经典的斯蒂芬·佩吉特“种子-土壤”理论，肿瘤转移过程大体是：具有转移能力的癌细胞（种子）从原病灶脱离——远处迁移——侵袭组织器官（土壤）——生长繁殖、转移瘤块生成等。这过程涉及细胞的黏附、迁移、侵蚀等几个环节，结合试验结果，提示沉默Bmi-1基因可从多环节产生抗侵袭转移作用：（1）诱导E-cadherin表达，这可使细胞间的黏附增强，抑制细胞的脱落分离；（2）抑制Vimentin、N-cadherin，这可降低细胞运动能力，抑制细胞迁移运动；（3）MMP-2表达减弱，TIMP-1表达增强，这可使细胞侵蚀能力减弱，从而使在“土壤”上种植机会减少。由此，沉默Bmi-1基因可遏制SCLC的转移。

本研究证明了抑制Bmi-1的表达可有效抑制SCLC的增殖及转移，这为以Bmi-1为靶点的新药开发提供了一定的理论与实验依据。

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