糖尿病大鼠肝脏syndecan-1和蛋白激酶C的表达变化

王静波 (解放军第309医院眼科，北京 100091)

肝脏是糖尿病(DM)受累的重要靶器官之一。DM患者由于对糖的利用障碍，需动员大量的脂肪，从而使游离脂肪酸过多流入肝脏。而游离脂肪酸在肝脏中进一步转化成甘油三酯(TG)，并促进极低密度脂蛋白(VLDL)的合成和分泌，从而导致以TG和VLDL升高为主的高脂血症。syndecan是硫酸肝素蛋白多糖家族成员。脊椎动物syndecan家族包括4个成员，即syndecan-1、-2、-3和-4。syndecan-1是 syndecan家族中研究最多、作用最广泛的成员，可参与细胞的分化、黏附和移行，在炎症、组织损伤和修复、脂质代谢等病理生理过程中起重要作用〔1〕。笔者既往的研究〔2～4〕表明，syndecan-1 可能参与糖尿病及其并发症的发生发展，但syndecan-1在DM肝脏中的表达尚不明确。本研究观察DM大鼠肝脏syndecan-1和信号通路蛋白激酶C(PKC)的表达变化。

1 材料与方法

1.1 试剂 链脲佐菌素(streptozotocin，STZ，Sigma公司，美国)，兔抗鼠syndecan-1多克隆抗体、小鼠抗大鼠PKC多克隆抗体(Santa cruz公司，美国)，枸橼酸盐粉剂、磷酸盐缓冲液(PBS)粉剂、二步法免疫组化检测试剂盒、二氨基联苯胺(DAB)试剂盒、苏木素(北京中杉金桥生物技术有限公司，北京)，安稳血糖仪及血糖测试条(长沙三诺有限公司)，冷冻包埋剂(樱花，美国)。

1.2 实验动物及模型制备 36只雄性SD大鼠，无特定病原体(SPF)级，体质量(120±20)g，由军事医学科学院动物中心提供。大鼠在SPF级动物中心饲养，室内温度保持在25℃左右，湿度约50%。明暗周期12 h，自由饮水和进食。适应性喂养1 w后，进行动物造模。造模前，禁食12 h(不禁水)。随机选取30只大鼠，STZ 65 mg/kg腹腔注射。对照组(6只SD大鼠)腹腔注射等量的枸橼酸盐溶液。72 h后测血糖，随机血糖≥16.7 mmol/L即为造模成功。每周监测血糖。30只大鼠中，STZ成功诱导DM大鼠27只(90.0%)，死亡2只(7.4%)。对照组大鼠体重增加明显，精神状况良好，毛皮有光泽，动作自如，反应灵敏。DM大鼠建模成功后，大鼠出现了典型的“三多一少”症状，多饮、多食、多尿，明显消瘦，精神逐渐萎靡，早期多动，后期反应迟钝，动作缓慢，毛竖而无光泽。

1.3 标本制备 造模成功后第3、6、9、12、15周(每个时间点随机选取5只大鼠)，分别采用过量氯胺酮麻醉致死，迅速摘除肝脏。切取块状肝脏大叶组织，冷冻包埋剂包埋，连续切出5 μm厚度切片，贴于免疫组化专用防脱载玻片上，晾干后甲醇固定，-80℃冰箱保存。

1.4 免疫组化染色及结果判读 冰冻切片用PBS冲洗，3%过氧化氢溶液室温10 min，PBS洗;稀释的syndecan-1抗体(1∶200)或PKC抗体(1∶200)室温孵育2 h，通用型IgG抗体-辣根过氧化物酶多聚体37℃ 20 min，PBS洗，DAB显色，PBS洗;苏木素复染，自然水冲洗;梯度酒精及二甲苯脱水，中性树胶封片，照相。所有切片由同一个经验丰富的病理科医师盲法阅片做出判定，每张切片观察5个×400倍视野。以组织切片背景清晰、细胞膜、细胞质染为淡黄至棕黄色为阳性细胞标志。结果判定标准:不着色为阴性，淡黄色及着色细胞＜1/3为弱阳性，黄色及着色细胞占1/3～1/2为中度阳性，棕褐色着色阳性细胞＞1/2为强阳性。

2 结果

2.1 肝脏syndecan-1的表达 syndecan-1的表达位于细胞质和细胞膜。在对照组大鼠，肝细胞排列整齐，syndecan-1呈阴性表达。DM 3 w时，大鼠肝细胞syndecan-1呈弱阳性表达。6 w时，肝细胞的胞质内可见小空泡，肝细胞syndecan-1呈强阳性表达;DM 9 w肝细胞的胞质内可见小空泡和15 w时肝细胞水肿明显，肝细胞syndecan-1的表达进一步增强，呈强阳性表达。见图1。

图1 大鼠肝细胞syndecan-1的表达(免疫组化，×400)

2.2 肝脏PKC的表达 PKC的表达定位于细胞质。在对照组大鼠，肝细胞PKC呈阴性表达。而在DM大鼠，3 w时肝细胞PKC呈弱阳性表达;随着DM病程增加，PKC的表达逐渐增强。糖尿病6 w时肝细胞的胞质内可见小空泡，肝细胞PKC呈中度阳性表达;9 w肝细胞的胞质内可见小空泡和15 w时，肝细胞PKC呈强阳性表达。

图2 大鼠肝细胞PKC的表达(免疫组化染色×400)

3 讨论

2型糖尿病(T2DM)患者肝脏病变的标准死亡率远远高于心血管并发症的标准死亡率。DM肝脏病变包括非酒精性脂肪肝病、肝硬化、肝细胞性肝癌、慢性肝炎、急性肝功能衰竭，其中最常见的是非酒精性脂肪肝病，其在T2DM患者中发病率达50%，在 DM 伴肥胖患者中发病率近100%〔4，5〕。

既往，国内外研究者对syndecan-1的研究主要围绕在该分子在组织损伤修复和炎症中的作用。研究〔1〕表明，syndecan-1是介导肝脂质代谢的首要蛋白多糖成分，在脂质代谢中起重要作用。该分子定位于肝细胞基底膜的微绒毛上，介导肝细胞对乳糜颗粒及 VLDL 残粒脂蛋白的结合与摄取〔1，6～9〕。syndecan-1的合成一旦被抑制，肝细胞对残粒脂蛋白的结合和摄取会明显减低〔1，6〕。在syndecan-1基因敲除的小鼠，肝脏细胞对TG的清除缓慢，对VLDL的结合、摄取和降解减慢〔1，6〕，血中TG含量明显升高。外源性补充syndecan-1后，TG的代谢恢复正常〔6〕。笔者既往的研究表明，DM患者血清中可溶性syndecan-1的水平与载脂蛋白A1呈负相关〔1〕。

研究表明，多数DM患者血中TG和VLDL明显升高〔1〕。笔者分析，过多的脂蛋白会刺激肝细胞表达多量syndecan-1以加速对脂蛋白的清除。但DM状态下，肝细胞syndecan-1表达上调的信号通路尚不明确。

DM并发症的发病机制十分复杂，包括非酶糖化作用增强、氧化还原反应、醛糖还原酶的激活及信号转导系统的激活。近年来，倍受关注的信号转导系统是二酯酰甘油(DAG)-PKC的激活。目前已发现哺乳动物PKC家族至少包括11种异型体(α、β1、β2、γ、δ、ε、ζ、η、θ、λ 及 μ)。DM 状态下，持续的高血糖使细胞内葡萄糖流量增加，葡萄糖代谢所引起的3-磷酸甘油醛生成增加，从而导致DAG合成增加。DAG为PKC的内源性激活剂。当细胞内DAG含量增加，可促使PKC移位至细胞膜而被激活。PKC通路的异常变化可能是高血糖引起的各种紊乱的共同通路〔10〕。PKC的持续激活可引起细胞损伤，久之则引起DM慢性并发症〔11〕。本研究发现，早期DM大鼠肝细胞内的PKC即被激活，并随着糖尿病病程的增加而呈明显升高趋势。笔者推测并分析，PKC的激活在DM肝病的发病中起着重要作用。Jung等〔12〕研究表明，PKCδ是通过对syndecan-1的调控而影响细胞黏附功能。在DM肝病的发病机制中，PKC是否可以通过调控syndecan-1而影响脂蛋白的代谢尚不清楚。

综上，在DM肝脏病变中，肝细胞syndecan-1蛋白的表达明显增强，肝细胞的PKC通路也被激活。但在DM肝病中，PKC与syndecan-1的相互作用及二者对肝脏脂蛋白代谢的具体作用及其机制尚不明确，需通过更深入的研究进一步证实。

1 Wang JB，Zhang YJ，Zhang Y，et al.Negative correlation between serum syndecan-1 and apolipoprotein A1 in patients with type 2 diabetes mellitus〔J〕.Acta Diabetol;2013;50(2):111-5.

2 Wang JB，Zhang YJ，Guan J，et al.Enhanced syndecan-1 expression on neutrophils in patients with type 2 diabetes mellitus〔J〕.Acta Diabetol，2012;49(1):41-6.

3 Wang JB，Guan J，Shen J，et al.Insulin increases shedding of syndecan-1 in the serum of patients with type 2 diabetes mellitus〔J〕.Diabetes Res Clin Pract，2009;86(2):83-8.

4 Tolman KG，Fonseca V，Tan MH，et al.Narrative review:hepatobiliary disease in type 2 diabetes mellitus〔J〕.Ann Intern Med，2004;141(12):946-56.

5 王蓉蓉，谢 琳，吴晓烨，等.银杏叶提取物对实验性2型糖尿病大鼠肝脏的保护作用〔J〕.中国病理生理杂志，2007;23(3):566-9.

6 Zeng BJ，Mortimer BC，Martins IJ，et al.Chylomicron remnant uptake is regulated by the expression and function of heparan sulfate proteoglycan in hepatoctes〔J〕.J Lipid Res，1998;39(4):845-60.

7 Stanford KI，Bishop JR，Foley EM，et al.Syndecan-1 is the primary heparan sulfate proteoglycan mediating hepatic clearance of triglyceride-rich lipoproteins in mice〔J〕.J Clin Invest，2009;119(11):3236-45.

8 Fuki IV，Kuhn KM，Lomazov IR，et al.The syndecan family of proteoglycans.Novel receptors mediating internalization of atherogenic lipoproteins in vitro〔J〕.J Clin Invest，1997;100(6):1611-22.

9 Fuki IV，Meyer ME，Williams KJ.Transmembrane and cytoplasmic domains of syndecan mediate a multi-step endocytic pathway involving detergent-insoluble membrane rafts〔J〕.Biochem J，2000;351(Pt3):607-12.

10 Dandona P，Aljada A，Chaudhuri A，et al.Metabolic syndrome:a comprehensive perspective based on interactions between obesity，diabetes，and inflammation〔J〕.Circulation，2005;111(11):1448-54.

11 Koya D，King GL.Protein kinase C activation and the development of diabetic complications〔J〕.Diabetes，1998;47(6):859-66.

12 Jung SY，Kim JM，Kang HK，et al.A biologically active sequence of the laminin alpha2 large globular 1 domain promotes cell adhesion through syndecan-1 by inducing phosphorylation and membrane localization of protein kinase C delta〔J〕.J Biol Chem，2009;284(46):31764-75.