醒神开郁方抗抑郁作用的实验研究

王 巍，王晓华（.解放军455医院药剂科，上海 0005；.解放军0医院药剂科，辽宁 沈阳 0003）

抑郁症是由各种原因引起的以抑郁为主要症状的一组心境障碍或情感性障碍，是一种以抑郁心境自我体验为中心的临床症状群或状态[1]。抑郁症严重困扰患者的生活和工作，给家庭和社会带来沉重的负担，约15%的抑郁症患者死于自杀，美国每年因抑郁症造成的经济损失高达437亿美元[2]。据国际卫生组织预测2020年抑郁障碍将成为全球第二位威胁人类健康、增加经济负担的疾患[2]。目前抗抑郁药多以西药为主，存在药物副作用多，疗效缓慢，且易复发，并有较强依赖性等问题[3-4]。因此，开发更加安全、高效、依赖性小的抗抑郁药物已成为当前研究的一个热点。醒神开郁方由石菖蒲、郁金、人参、当归、炒枣仁、山茱萸、 五味子、川芎、丹参、灵芝组成，全方具有醒脑开郁、扶正固本之功效。本研究以小鼠悬尾和强迫游泳实验、自主活动实验、利血平诱导小鼠体温下降实验为基础，探讨醒神开郁方的抗抑郁作用，为其开发为药品及临床应用提供参考。

1 材料

1.1 实验动物

ICR小鼠，清洁级，雄性，体质量18 ~ 20 g，购于上海斯莱克实验动物有限责任公司，实验动物许可证号：SCXK（沪）2012-0002。动物饲养于第二军医大学实验动物中心，动物实验室许可证号：SYXK（沪）2012-0003；在相对温度22 ~ 24 ℃、相对湿度40% ~70%的实验室内饲养，光照时间随自然变化，供给常规颗粒饲料和过滤水，自由饮食饮水。

1.2 实验药物

醒神开郁方制备：将组方中的各药材洗净、捣碎，浸泡过夜，按料液比1∶8加水，煮沸后再加热1 h，重复上述过程两次，过滤药渣；合并两次药液并蒸干后干燥保存备用。制得醒神开郁方干粉得率为12.84%。所用原药材均购于上海雷允上药店。

盐酸氟西汀胶囊（礼来苏州制药有限公司，规格：20 mg，批号2072A）；盐酸氯米帕明片（上海信谊九福药业有限公司，规格：25 mg，批号120613）；利血平注射液（广东邦民制药厂有限公司，规格：1 mg/mL，批号090512）。

1.3 试剂及仪器

去甲肾上腺素（NE）（批号088K1147）、5-羟色胺（5-HT）（批号0001431934）、多巴胺（DA）（批号BCBC7614V）均为Sigma公司产品。

JD-2型电子秒表（上海金雀表业有限公司）；CP225D型电子分析天平（北京赛多利斯仪器系统有限公司）；T15SL型电子体温计（广州市健奥科技有限公司）；TDL-80-2B型台式离心机（上海安亭科学仪器厂）；YLS-1A多功能小鼠自主活动记录仪（济南益延科技发展有限公司）；新芝DY89-Ⅱ型电动玻璃匀浆机（宁波新芝生物科技股份有限公司）；F-4500荧光分光光度计（日立公司）。

2 方法

2.1 分组及给药

ICR小鼠随机分为5组，每组10只。分别为空白对照组（因受试药物均用0.5% CMC-Na溶液溶解，因此空白对照组给予0.5% CMC-Na溶液），醒神开郁方低剂量（1.50 g·kg-1）、中剂量（3.00 g·kg-1）、高剂量（6.00 g·kg-1）组和阳性药物组。阳性药物组：小鼠悬尾、强迫游泳实验以及自主活动实验给予盐酸氟西汀胶囊（10 mg·kg-1）；利血平拮抗实验给予盐酸氯米帕明片（30 mg·kg-1）。每天灌胃一次，灌胃量0.02 mL·g-1，连续给药7 d。

2.2 小鼠自主活动实验[5]

末次给药后1 h，将小鼠放入YLS-1A多功能小鼠自主活动记录仪内，适应3 min后，测定5 min内小鼠的自主活动次数。

2.3 小鼠悬尾实验[6]

末次给药后1 h，用胶带将小鼠尾在距尾尖2 cm处粘在一水平支撑物上，使动物成倒挂状态，支撑物放置于一敞口箱内，使小鼠头部离底面约5 cm。小鼠悬挂6 min，记录后4 min内累计不动时间。

2.4 小鼠强迫游泳实验[7-8]

末次给药后1 h，将小鼠单独置于高20 cm、直径14 cm的圆柱形玻璃缸中，缸内水深10 cm，水温23 ~25 ℃。放入小鼠使其游泳6 min，记录后4 min内累计不动时间。

2.5 利血平拮抗实验[9-10]

该实验中增加设置正常对照组小鼠10只；空白对照组给予0.5% CMC-Na溶液。各组动物末次给药前1 h用电子温度计插入小鼠肛门内约1.5 ~ 2 cm处测定肛温，作为正常体温值。除正常对照组外，其他各组测体温后腹腔注射利血平注射液4 mg·kg-1（0.2 mg·mL-1，0.02 mL·g-1体质量）。观察指标：1）灌胃给药4 h后，再次测定各组动物的肛温，记录前后体温变化的差异。2）观察1 h后15 s内小鼠眼睑下垂的情况。按Rubin分级标准，判断下垂度。0度：正常开目；1度：眼睑下垂1/4；2度：眼睑下垂1/2；3度：眼睑下垂3/4；4度：眼睑完全闭合。3）小鼠脑内单胺递质含量测定。给药后禁食不禁水，24 h后处死小鼠，迅速断头取出大脑，冰浴中匀浆，3000 r·min-1离心10 min，取上清液，荧光法测定单胺类神经递质NE、5-HT以及DA的含量。

2.6 统计学处理

3 结果

3.1 对小鼠自主活动和不动时间的影响

由表1结果可知，醒神开郁方低、中、高剂量组小鼠自主活动数与空白对照组比较均无显著性变化（P >0.05），表明醒神开郁方对小鼠自主活动无显著影响。与空白对照组比较，阳性药盐酸氟西汀组能够显著缩短小鼠悬尾和强迫游泳不动时间（P < 0.01）。醒神开郁方低剂量组较空白对照组能缩短小鼠悬尾和强迫游泳不动时间（P < 0.05）；醒神开郁方中、高剂量组较空白对照组均能缩短小鼠悬尾和强迫游泳不动时间，具有显著性差异（P < 0.01）。实验结果表明醒神开郁方具有抗抑郁作用。

表1 醒神开郁方对小鼠自主活动和不动时间的影响. n = 10，±sTab 1 Effect of Xingshen Kaiyu prescriptions on the spontaneous motor activity and the immobility duration in mice. n = 10，±s

表1 醒神开郁方对小鼠自主活动和不动时间的影响. n = 10，±sTab 1 Effect of Xingshen Kaiyu prescriptions on the spontaneous motor activity and the immobility duration in mice. n = 10，±s

注：与空白对照组比较，*P < 0.05，**P < 0.01Note: compared with the blank control group, *P < 0.05, **P < 0.01

组别 剂量/g·kg-1自主活动计数/次悬尾不动时间/s强迫游泳不动时间/s空白对照组 – 202.1±19.8 113.6±29.6 98.3±22.8盐酸氟西汀组 0.01 204.2±23.4 64.6±22.2** 41.1±12.9**醒神开郁方低剂量组1.50 189.3±17.1 82.9±20.3* 70.4±22.4*醒神开郁方中剂量组3.00 201.8±19.0 75.6±17.7** 67.5±12.8**醒神开郁方高剂量组6.00 192.5±18.9 68.7±18.8** 58.1±23.3**

3.2 对利血平所致小鼠体温下降和眼睑下垂的影响

小鼠注射利血平后，出现了明显的上睑下垂、体温下降等症状，空白对照组与正常对照组比较差异非常显著（P < 0.01）。醒神开郁方中、高剂量组较空白对照组显著抑制利血平所致小鼠体温的下降（P <0.05，P < 0.01）；与空白对照组比较，醒神开郁方低、中、高剂量组显著拮抗利血平所致小鼠眼睑下垂作用（P < 0.05，P < 0.05，P < 0.01）。结果见表2。

表2 醒神开郁方对利血平所致小鼠体温下降和眼睑下垂的影响.n = 10，±sTab 2 Effect of Xingshen Kaiyu prescriptions on the ptosis and hypothermia induced by reserpine in mice. n = 10，±s

表2 醒神开郁方对利血平所致小鼠体温下降和眼睑下垂的影响.n = 10，±sTab 2 Effect of Xingshen Kaiyu prescriptions on the ptosis and hypothermia induced by reserpine in mice. n = 10，±s

注：与空白对照组比较，*P < 0.05，**P < 0.01；与正常对照组比较，ΔP < 0.05，ΔΔP < 0.01Note: compared with the blank control group, *P < 0.05, **P < 0.01;compared with normal control group, ΔP < 0.05, ΔΔP <0.01

组别 剂量/g·kg-1 肛温下降变化/℃眼睑下垂程度/度正常对照组 – 0.5±0.3 0空白对照组 – 3.0±0.7ΔΔ 3.3±0.9Δ Δ盐酸氯米帕明组 0.03 1.0±0.4** 1.3±0.9**醒神开郁方低剂量组 1.50 2.4±0.7 2.1±1.2*醒神开郁方中剂量组 3.00 2.1±0.6* 1.9±1.1*醒神开郁方高剂量组 6.00 1.5±0.6** 1.6±1.0**

3.3 对脑内单胺类神经递质的影响

实验结果显示，空白对照组小鼠脑组织内单胺类神经递质NE、5-HT、DA含量减少，与正常对照组比较均有显著性差异（P < 0.01）。与空白对照组比较，醒神开郁方低剂量组能够显著升高小鼠脑组织内NE和5-HT含量（P < 0.01），对小鼠脑组织内DA含量也有升高，但无统计学差异。与空白对照组比较，醒神开郁方中、高剂量组均显著升高小鼠脑组织内NE和5-HT含量（P < 0.01）；醒神开郁方中、高剂量组小鼠脑组织内DA含量较空白对照组的升高具有显著性差异（P < 0.05，P < 0.01）。详见表3。

表3 醒神开郁方对小鼠脑内单胺类神经递质的影响. n = 10，±sTab 3 Effect of Xingshen Kaiyu prescriptions on the levels of monoamine neurotransmitter in brain of mice. n = 10，±s

表3 醒神开郁方对小鼠脑内单胺类神经递质的影响. n = 10，±sTab 3 Effect of Xingshen Kaiyu prescriptions on the levels of monoamine neurotransmitter in brain of mice. n = 10，±s

注：与空白对照组比较，*P < 0.05，**P < 0.01；与正常对照组比较，ΔP < 0.05，ΔΔP < 0.01Note: compared with the blank control group, *P < 0.05, **P < 0.01;compared with normal control group, ΔP < 0.05, ΔΔP < 0.01

组别 剂量/g·kg-1 NE/ng·g-1 5-HT/ng·g-1 DA/ng·g-1正常对照组 – 613.2±72.0 494.8±38.9 821.8±112.2空白对照组 – 303.8±48.8ΔΔ 262.9±38.2ΔΔ 399.2±61.1ΔΔ盐酸氯米帕明组0.03 493.3±62.0** 364.8±47.6** 589.2±108.9**醒神开郁方低剂量组1.50 406.1±66.8** 330.9±47.0** 488.8±66.9醒神开郁方中剂量组3.00 458.4±92.1** 353.4±54.8** 514.5±72.4*醒神开郁方高剂量组6.00 507.8±72.8** 380.7±40.8** 566.2±87.4**

4 讨论

强迫游泳和悬尾实验属于行为绝望模型，是经典的抗抑郁药物筛选模型，被广泛用于抗抑郁药物的研究。但这两种模型也存在一定的局限性，一些增加动物活动的兴奋性药物也可能出现假阳性结果。自主活动实验可以有效的反映动物自发行为、活动及情绪状态，其活动强度在一定程度上也可反映中枢神经系统的兴奋或抑制状态[11]。本研究中小鼠自主活动实验结果显示，空白对照组小鼠自主活动次数均值202.1次，醒神开郁方低、中、高剂量组小鼠自主活动次数均值分别为189.3次、201.8次和192.5次；各组间比较无显著性变化，表明醒神开郁方对小鼠自主活动无显著性影响。

小鼠在悬尾及强迫游泳实验中出现的不动状态反映了动物的绝望行为，可模拟人类的抑郁状态。悬尾和强迫游泳实验结果显示，醒神开郁方能显著缩短小鼠悬尾和强迫游泳不动时间，表明其具有较强的抗抑郁作用，对中枢神经系统无兴奋或抑制作用，其抗抑郁作用并非中枢兴奋或抑制作用所致，可能是通过参与调节中枢不同单胺能神经传导功能所产生抗抑郁作用[12]。

抑郁症发病机制至今未明确阐明，但大量实验研究表明单胺类神经递质尤其是5-HT、NE以及DA含量改变与抑郁症有密切关系[13]；也有报道指出脑内单胺类递质缺乏或相对不足是导致抑郁症的最直接因素[14-15]。利血平诱导体温下降实验是研究抗抑郁药物作用机理经典实验之一，该方法简单可靠。利血平是一种囊泡再摄取抑制剂，它使递质留在囊泡外，易被单胺氧化酶降解，从而使NE、DA和5-HT等耗竭，引起体温下降、上眼睑下垂、少动等症状。本实验结果显示，醒神开郁方能显著提高小鼠脑组织内单胺类神经递质NE、5-HT、DA含量，提示其抗抑郁作用的机制与增加脑内单胺类神经递质的含量，调节NE、5-HT和DA能神经的活性有关。醒神开郁方可通过改变中枢单胺递质的含量，继而影响其他系统功能活动从而发挥抗抑郁作用。

综上，醒神开郁方抗抑郁作用疗效显著，由于中药方剂具有多成分、多环节、多靶点的作用特性，故对醒神开郁方中具有抗抑郁作用的活性部位、活性成分及其他抗抑郁作用机理的阐明尚需进一步的研究。